核酸质谱仪检测单核苷酸多态性的临床应用

张阳东，宋秀军，高 峥，牛冬梅，吕 进，楚瑞雪

（1.火箭军特色医学中心研究部，北京 100088；2.火箭军96606 部队医院，河南洛阳 471003；3.解放军总医院京中医疗区礼士路门诊部，北京 100820）

0 引言

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的高密度、高保守的DNA 序列多态性，是导致人群个体间遗传差异的主要原因。特定基因SNP 的检测分析在疾病的诊断特别是出生缺陷疾病的防控、药物种类和剂量的指导等方面有着非常重要的作用。SNP的常见检测方法包括直接测序法、基因芯片法、PCR-限制性片段长度多态性法、荧光标记的单碱基延伸法和核酸质谱法等。其中核酸质谱法是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术，根据解吸的核酸分子的质量和在真空腔中的飞行时间差异，通过计算分子量进而获得分析物的基因型信息。在pmol 水平可鉴别仅1 个碱基差别的不同DNA 片段是核酸质谱仪进行SNP 分型的基础。核酸质谱技术具有高灵敏度、高通量和高精确度等优势，是国际业界公认的SNP 分型的黄金标准[1]。为了阐述核酸质谱仪的SNP 基因分型技术在疾病的分子诊断和机制研究中的优势，使该技术在临床检验中逐渐普及，本文对核酸质谱仪的构造、技术原理和检测程序进行介绍，并对核酸质谱仪检测SNP 在出生缺陷疾病筛查诊断和个性化医疗等领域中的应用进行阐述。

1 核酸质谱仪的组成、工作原理和检测流程

1.1 核酸质谱仪的组成

核酸质谱仪主要由进样系统、基质辅助激光解吸电离离子源（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）、飞行时间质量分析器（time of flight mass analyzer，TOF）、检测接收器和配套分析软件5个部分组成。设备进样系统提供标准的96 和384 制式芯片，可满足不同检测量的需求。一张芯片可同时分析多个检测项目并可分多次使用，方便检测内容的灵活定制或修改，减少拼凑样本的限制，大大提高了检测效率。该设备的全封闭设计可避免人为操作误差及潜在的交叉污染风险。

1.2 核酸质谱仪的工作原理

MALDI 应用激光照射核酸分子与基质形成的共结晶薄膜，基质吸收激光能量并传递给核酸分子，从而使基质和核酸分子间发生质子转移，产生完整的电离化核酸分子。TOF 使离子化的核酸分子在电场作用下加速飞过真空管腔，根据样品分子的电荷及分子量不同以及到达检测接收器的时间差异，智能分析SNP 的基因型。

1.3 核酸质谱仪检测SNP 的流程

1.3.1 样品的准备

准备核酸质谱仪可直接检测的稀有样本和降解样品，以及可兼容全血、唾液、口腔黏膜、干血斑、活检组织、石蜡包埋组织、血浆等各类样本。

1.3.2 扩增和延伸反应的引物设计

由于核酸质谱仪的SNP 分型是一种在PCR 基础上进行单碱基延伸的技术，因此相关的引物设计必须遵循PCR 引物设计原则。引物应尽量避免自身形成发卡结构及5 个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的连续序列。由于同一体系可进行多达几十重反应，引物间需避免互补，防止出现非特异性扩增延伸而干扰检测结果。

1.3.3 PCR 扩增、纯化及单碱基延伸反应

在核酸扩增阶段，通过多重PCR 扩增多达含40个待检SNP 的目标片段。PCR 结束后加入虾碱性磷酸酶进行纯化，去除反应液中的脱氧核苷酸。随后在反应液中加入针对SNP 位点的特异性单碱基延伸引物及经修饰的双脱氧核苷酸进行单碱基延伸反应，使等位基因的延伸产物仅表现为末端一个碱基的差异。

1.3.4 核酸质谱仪的分型检测

将完成延伸的反应液与树脂混合进行离子交换，去除吸附于DNA 片段上的离子，再经脱盐后将反应液点在靶板基质上形成共结晶。基质可增强核酸分子对激光的吸收，保护核酸分子的稳定性。核酸质谱仪根据不同质量的单碱基的飞行时间差异自动分析确定对应的碱基类型。整个检测流程和数据分析简单，检测周期短。另外，由于核酸质谱技术采用物理方法学，检测过程只需简单的PCR 及延伸试剂，无需荧光探针和荧光类试剂，因此试剂成本低。

2 核酸质谱仪在出生缺陷防控中的临床应用

出生缺陷是指由遗传等因素导致的婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢异常。出生缺陷严重影响儿童的健康和出生人口素质，因此对遗传缺陷疾病开展筛查工作具有重要意义。我国已通过孕前、孕期及出生后的筛查建立了出生缺陷三级预防体系，做到早诊断、早干预、多层面预防出生缺陷的发生[2]。通过对母体循环中胎儿DNA 的SNP 进行分型，即可获得胎儿的遗传信息，除了可测定胎儿染色体畸变、循环核酸[3]及DNA 半合子22q11.2 缺失外[4]，核酸质谱仪更多应用于需进行多基因多位点检测的遗传性耳聋、地中海贫血和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症等疾病的产前无创诊断[3]。

2.1 核酸质谱仪在遗传性耳聋筛查诊断中的临床应用

耳聋是最常见的遗传性疾病之一。我国每年出生的约90 万例遗传缺陷的新生儿中约三分之一为听力障碍[5]。国内的流行病学调查结果显示[6-7]，我国的遗传性耳聋大多数为单基因遗传病，主要与GJB2、GJB3、12SrRNA 及SLC26A4 基因有关。其中GJB2 基因突变是通过影响缝隙连接蛋白的合成而导致内耳钾离子循环和转运异常使听力损失。GJB3 基因突变可影响缝隙连接蛋白的合成导致高频听力下降。12SrRNA 基因是一个与氨基糖甙类抗生素致聋相关的基因。氨基糖苷类抗生素进入携带有该突变基因的人体后，通过损伤内耳毛细胞导致永久性听力损失[8]，患者需终身禁用氨基糖苷类抗生素。SLC26A4 基因位点突变主要引起内耳淋巴液的流动异常，使内耳毛细胞受损和听神经萎缩而导致听力下降[9]。由于大部分遗传性耳聋为常染色体隐性遗传，隐性耳聋基因携带者的听力正常，因此为听力正常的育龄夫妇进行常见耳聋基因检测十分必要。

2013 年深圳华大基因科技有限公司的曾云等[10]依据我国大规模耳聋分子流行病学研究结果，应用核酸质谱仪构建了GJB2、GJB3、12SrRNA 和SLC26A44个遗传性耳聋基因共20 个SNP 的分型检测方法，该检测方法具有位点多、覆盖率高、快速、准确、高通量、低成本等特点，适于大规模筛查，为先天性耳聋和药物性耳聋的及早干预和用药警示提供了分子生物学依据。核酸质谱仪的应用使得检测费用的大幅度降低也为2014 年我国政府开展新生儿耳聋基因的免费筛查提供了经济支撑，具有重要的社会价值。

2.2 核酸质谱仪在遗传性代谢疾病诊断中的临床应用

地中海贫血是珠蛋白基因突变或缺失导致珠蛋白链合成障碍、比例失衡引起红细胞损伤、溶血从而导致红细胞新陈代谢异常的常染色体隐性遗传疾病。目前已知β 珠蛋白基因致病的点突变就超过200个[11]。地中海贫血在临床表现上具有非常显著的异质性，建立快速高通量的珠蛋白常见基因突变位点的检测方法对溶血性贫血的诊断及防止出现重型地中海贫血患儿显得尤为重要。应用核酸质谱仪对β 珠蛋白基因的10 个常见SNP 位点进行检测，既可克服β地中海贫血诊断实验中传统的血红蛋白A（HbA）定量的灵敏度不高、特异性不强的缺点，也可克服PCR结合反向点杂交法操作烦琐、通量低、费用昂贵的不足[12]。临床实践证明，应用核酸质谱仪对SNP 位点进行分型是新生儿β 地中海贫血大样本筛查和诊断的有效方法。

G6PD 缺乏症因G6PD 基因突变使红细胞磷酸戊糖途径中还原型辅酶Ⅱ和还原型谷胱甘肽生成减少，导致红细胞膜稳定性和抵抗氧化损伤能力下降而引起溶血性贫血。该病重在早期诊断预防，患者应避免摄入可能诱发该病的食物及药物[13]。在已报道的G6PD 的近200 个基因突变型中，约85%表现为单个碱基的多态性[14]。我国人群中G6PD 最常见的基因点突变有10 多种，其中以1376G>T、1388G>A和95A>G 突变频率最高[15]。根据我国的流行病学研究，包括专家共识及诊治指南等，陶子馨[16]选取了我国人群常见的16 种G6PD 缺乏症致病突变位点，应用核酸质谱仪对SNP 进行了基因分型，检测出的位点情况符合我国的流行病学调查，结果与测序检测一致，且可用于排除G6PD 酶活性检测的假阳性。

应用核酸质谱仪开展遗传缺陷相关基因SNP的高通量检测可弥补传统检测方法的局限性，通过基因携带者经遗传咨询可寻找潜在的患者。目前我国通过对地中海贫血[12，17]、G6PD 缺乏症[18]的多基因多位点SNP 检测，使严重出生缺陷得到了有效控制。

3 核酸质谱仪在个性化医疗中的临床应用

近年来，临床用药已由经验用药和循证用药阶段逐渐发展为个性化用药阶段。药物基因组信息是当前个性化精准医疗的一个重要部分。药物基因组学是通过对药物代谢酶、受体和转运蛋白等基因的研究，阐明不同基因型个体的药物药效和毒性，确定药物作用靶点，指导不同基因型个体的临床用药。不同个体的药物遗传多态性是药物基因组学的基础。药物基因组学的临床实施可以规避有毒副作用的药物，实现个性化医疗，提高治疗的功效、安全性和成本效益。药物经血液循环主要在肝脏代谢，细胞色素酶P450（CYP450）是人体肝脏中最主要的药物代谢酶系统，其多态性与药物的代谢速率和清除率直接相关[19]。CYP450 含多个亚族，其中CYP2C9 和CYP2C19是遗传多态性中与我国人群药物代谢最紧密相关的2 种酶[20]。核酸质谱仪的临床应用很好地解决了药物基因组学同时检测多个变异位点的需求[21-23]，特别是在心血管疾病、肿瘤靶向治疗、病原体分型及耐药检测等精准用药的开展中发挥了至关重要的作用。

3.1 核酸质谱仪在心血管疾病精准用药中的临床应用

心血管疾病主要包括高血压、心绞痛、心律失常、心肌梗死等，是死亡率最高的疾病。心血管疾病大多为慢性病，药物治疗一般较为复杂。研究结果[24-26]显示，临床上治疗心血管疾病常规使用的药物因体内代谢、转运及作用靶点相关基因的遗传变异和表达水平变化，通过影响药物的体内浓度和敏感性而导致药物反应个体差异。华法林是预防和治疗血栓栓塞性疾病最常用的口服抗凝药，其安全治疗窗狭窄，抗凝不适度时易引起出血、栓塞甚至死亡等严重并发症。华法林代谢酶基因如肝脏中细胞色素P450 2C9的SNP 对华法林的药物代谢动力学性质产生重要影响。应用核酸质谱仪同时对华法林代谢酶的多个SNP 进行基因分型对指导华法林初始剂量的选择、降低抗凝出血的风险具有重要的指导意义[27]。

国内刘朝晖等[28]应用核酸质谱仪对心血管相关药物氯吡格雷、华法林、硝酸甘油和他汀类等相关的11 个基因17 个SNP 进行了检测，同时对该方法的准确度、特异性、测定下限、精密度和抗干扰水平进行了评价。研究结果显示，核酸质谱仪检测SNP 性能稳定，检测下限可达0.4 ng DNA。该设备对基因组和PCR 各中间产物（扩增产物、消化产物和延伸产物）气溶胶有很强的抗干扰能力，且芯片不同基质间无交叉污染，可以保证检测结果的准确可靠。

目前，国内核酸质谱仪厂家已研制开发涵盖20多个心血管相关药物基因共数十个SNP 位点的检测试剂盒，通过药物相关基因多态性分析指导临床个体化用药，大大地提高了心血管药物使用的安全性、有效性和经济性。

3.2 核酸质谱仪在肿瘤靶向治疗中的临床应用

肿瘤是目前严重威胁人类健康的一类疾病。通过SNP 的基因分型，不仅可以对健康、亚健康人群进行肿瘤风险评估[29-30]，开展肿瘤的早期筛查[31-32]，还可以为肿瘤治疗方案的选择以及预后预测提供重要依据[33]。基于遗传信息对肿瘤患者进行个体化治疗已得到临床的广泛关注[34]。肺癌在我国恶性肿瘤的发病率中居首位，防治任务艰巨[35]。研究结果显示，肺癌的发病、靶向治疗以及转移等都与基因的变异相关[36]。在非小细胞肺癌的临床治疗中，常通过对EGFR和ALK 基因的突变位点进行检测来选择靶向治疗的酪氨酸激酶抑制剂[37-38]。目前针对结直肠癌的靶向治疗药物主要为抗表皮生长因子受体单抗（西妥昔单抗和帕尼单抗），其疗效与KRAS、NRAS 和BRAF 基因型密切相关。通过对这3 个基因16 个突变位点的检测，可为结直肠癌患者的个体化治疗选择合适的靶向治疗方案[39]。目前，基于核酸质谱技术已研发上市针对不同肿瘤的风险评估、用药指导、耐药监控、良恶性鉴别、疗效评估的试剂盒。

田红霞等[40]根据中国人群肺癌的发病机理、放化疗、靶向耐药以及转移等相关的靶基因或传导通路基因，应用核酸质谱仪构建了可同时检测EGFR、ALK 和KRAS 等13 个肺癌相关基因共99 个SNP位点的方法。该方法以96 或384 孔板多重反应分析为基础，在12 孔同步检测13 个基因的99 个SNP位点，实现了“单个小样本多基因的检测”，使小样本最大化使用、获得最大信息量。通过对肺癌细胞系和肺癌组织样本的检测并与进口试剂盒及直接测序法的对比验证，显示该方法灵敏度高、特异性好，适合中国肺癌人群。由于自主研发的高通量检测试剂盒大大降低了患者的临床检测费用，因此核酸质谱仪具有广阔的临床应用前景。

3.3 核酸质谱仪在病原体分型及耐药检测中的临床应用

核酸质谱仪的另一重要应用领域是通过检测病原体管家基因的SNP 进行多位点序列分型，根据基因分型结果对病原体进行鉴定并提供病原体的用药信息。我国是全球结核第三高发国家，每年有超过10 万例的新发耐多药患者。结核杆菌镜检阳性率低，培养困难[41]。虽然众多学者应用核酸质谱仪的筛选结果显示中国汉族人群的sp110 基因、MMP9 基因及IL 基因等的多个SNP 与结核的易感性相关[42-44]，但核酸质谱仪在结核病个性化治疗中的主要应用还是通过构建对感染的结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA 和rrs 等基因的50 余个耐药相关位点进行检测，高通量快速完成结核分枝杆菌的鉴定与利福平、异烟肼、氟喹诺酮类及二线注射类抗结核药物的多重耐药分析，将其作为临床鉴定结核分枝杆菌药敏试验结果的有效补充，为结核病的诊断和用药提供准确信息[45-47]。

乙肝患者经长期口服核苷（酸）类抗病毒药物治疗后体内的乙肝病毒可发生基因变异而导致耐药。开展针对不同核苷（酸）类药物病毒耐药检测对于调整治疗方案、指导远期治疗具有重要意义。目前，我国核苷（酸）类抗病毒药物主要有阿德福韦酯、替比夫定、拉米夫定和恩替卡韦4 种，每一种药物的耐药菌株的突变位点不同。利用核酸质谱仪建立的乙肝病毒耐药基因突变检测体系，可同时检测多达37 个耐药突变SNP 位点，其检测灵敏度和检出率均高于线性探针分析法和多温度单链构象多态性法，可为乙肝患者个性化临床治疗方案的制订及调整提供重要依据[48-49]。

4 结语

核酸质谱仪在出生缺陷防控和个性化精准医疗中发挥了重要作用。基于高通量、快速、准确的优势，核酸质谱仪也被广泛应用于疾病的机制研究，筛选与糖尿病[50-51]、冠心病[52-53]等常见疾病相关的危险因素。在病原学诊断领域，核酸质谱仪克服了传统的病原体分离培养周期长和生化鉴别困难等缺点，为感染性疾病的数十种病原体的高效鉴别诊断[54-55]提供了新方法。

为了在临床检测中普及核酸质谱技术，医疗管理部门需加大投入和政策支持，指导研发机构提高设备的国产化水平，特别是核心部件的国产化，降低实验室购买设备的成本；加大多种疾病诊断试剂盒的研发力度，国内通用型核酸质谱仪在临床应用的获批和试剂盒的不断研发生产，将使该设备在精准医疗、遗传疾病筛查、疾病预后判断、公共健康等临床分子诊断领域具有更广泛的应用前景，开启核酸质谱仪在临床应用的新纪元。