连接蛋白43:致盲性眼病治疗新靶点

程馨仪，李 慧，王 方,2

0 引言

缝隙连接(gap junctions,GJs)又称缝隙连接斑块，由数十个甚至数千个排列整齐且紧密相邻的通道组成。每一个完整的通道分别由相邻细胞膜上两个半通道(hemichannel)对接而成。半通道是由6个连接蛋白(connexins,Cxs)亚单位构成的六聚体中空结构，其中心孔径为1.5nm，允许钙离子等可溶性离子和分子量小于1.2kDa的小分子包括营养素、氨基酸、核苷酸、多胺、第二信使或调节分子等直接通过。该通道具有亲水性、低选择性和低电阻等特点，主要功能是介导细胞间电和化学信号的传递，即缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)，确保细胞代谢和电耦合，从而维持组织和器官内环境平衡[1-2]。

Cxs在人类和小鼠中分别存在21种和20种亚型。其中，连接蛋白43(connexin 43,Cx43)是分布最广泛、研究最深入的一种亚型[3]。Cx43不仅参与细胞间通讯，还参与细胞自噬、黏附、迁移、增殖分化等过程[4]，它对维持正常眼组织的生理功能具有重要意义。研究发现，Cx43在角膜炎、白内障、青光眼、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)等常见致盲性眼病中发挥重要作用，参与炎症、氧化应激、上皮-间充质样细胞转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、血管渗漏与新生血管形成等病理过程。目前，多项研究表明靶向Cx43治疗具有良好的临床应用前景，比如以Cx43为靶点治疗角膜炎的药物已进入人类临床试验Ⅱ期。本文将就Cx43在上述常见致盲性眼病发病机制中的作用和靶向Cx43治疗进展作一综述。

1 Cx43的结构与功能

Cx43基因GJA1 (gap junction protein alpha1)定位于6q22.31，其编码的蛋白质分子质量为43kD，故命名为Cx43[4]。Cx43单体结构由4个跨膜结构域、2个胞外环和3个胞内结构域组成，胞内结构域包括胞内环、氨基末端和羧基末端。Cx43与其他Cxs亚型的主要区别在于胞内环和羧基末端氨基酸序列的差异[5]。Cx43羧基末端含有150个氨基酸，存在多种转录后修饰和蛋白质结合的位点，调控Cx43蛋白的内吞、降解及通道门控，还可以与β-连环蛋白、周期蛋白E、Src蛋白激酶等相互作用，调节细胞的生长、分化和迁移等正常生理过程[6]。在炎症、氧化应激、pH值降低等病理条件下，Cx43半通道开放并在细胞质和细胞外环境之间形成直接联系，允许Na+、K+自由通过，引起细胞内钙超载，促进小分子如ATP、谷氨酸等逃逸，抑制细胞代谢和细胞膜去极化，导致细胞损伤[7]。

2 Cx43与常见致盲性眼病

眼组织中，Cx43主要分布于角膜、晶状体和视网膜，涉及的种属广泛，包括人、鼠、兔、鸡、猪、斑马鱼等[8]。Cx43表达和分布异常，或Cx43介导的细胞间通讯功能异常与多种致盲性眼病密切相关。

2.1Cx43与角膜炎Cx43分布于角膜的上皮细胞层及基质层，形成角膜细胞间相互通讯的功能性网络[9-10]。Chen等[11]通过选择性地损伤体外培养的原代人或小鼠角膜基质细胞中的单个靶细胞，引起靶细胞膜的短暂破裂，发现Cx43介导了靶细胞与其相邻细胞间的Ca2+传导，Ca2+内流显著增加。研究发现，病毒的双链RNA类似物聚肌苷酸胞苷酸能够抑制人角膜成纤维细胞中Cx43表达和GJIC活性，提示病毒感染下调GJIC的活性可能导致角膜基质内稳态破坏[10]。在离体培养的人角膜成纤维细胞中，Cx43可以被肿瘤坏死因子α介导的泛素-蛋白酶体途径降解[12]。而在化学烧伤或感染的人角膜临床样本中，Cx43信使RNA和蛋白表达水平显著上调，与角膜炎症密切相关[13]。Qin等[14]采用shRNA-Cx43腺病毒抑制真菌性角膜炎小鼠模型中Cx43的表达或通过IL-17/Akt信号通路抑制Cx43，发现Cx43表达减少可以促进角膜缘血管内皮细胞激活，调节角膜早期炎症反应，利于抵抗真菌感染和角膜上皮损伤愈合。

2.2Cx43与白内障Cx43主要分布于晶状体的上皮细胞，其表达随着晶状体上皮细胞分化为成熟的纤维细胞而下调[15]。由于晶状体无血管，晶状体的大部分代谢物质通过晶状体上皮细胞间和晶状体纤维之间的缝隙连接通道进行运输[16]。与正常透明晶状体相比，Cx43在白内障患者的晶状体中表达上调近50%[17]。年龄相关性白内障的风险随着氧化应激和紫外线暴露增加[18-19]，采用过氧化氢或紫外线辐射处理人晶状体上皮细胞HLE-B3可以激活Cx43半通道，促进氧化还原代谢分子如过氧化氢、氧化型谷胱甘肽、还原型谷光甘肽的内流或外流，进而保护晶状体免受氧化应激损伤[20]。Liu等[21]通过表达泛素-K6W的转基因小鼠发现，泛素化修饰的Cx43在小鼠晶状体上皮细胞中积累，导致Ca+浓度显著升高及钙蛋白酶过度激活，诱发白内障。此外，DeRosa等[22]报道Cx43可以与Cx50-S50P突变相互作用，抑制小鼠晶状体上皮细胞中Cx43介导的GJIC，促进白内障形成。

2.3Cx43与青光眼研究发现，Cx43在青光眼患者视神经和视网膜组织中表达升高并与星形胶质细胞重塑和轴突顺行运输有关[23]，星形胶质细胞重塑促进了视神经筛板区结构的改变，这一过程可促进青光眼进展[24]。Liu等[25]降低大鼠的眼灌注压并向其玻璃体腔注射靶向Cx43基因的腺相关病毒载体以抑制胶质细胞中Cx43的表达，发现Cx43表达降低能够损害小动脉和小静脉的血管反应性，间接证明了Cx43介导的胶质细胞GJIC具有主动调节静息小静脉直径的生理功能。在单侧持续眼压升高的小鼠模型中，Cx43介导星形胶质细胞间代谢物质的重新分布，缓解了高眼压所致的视神经功能损伤[26]。此外，Xu等[27]在慢性眼压升高的小鼠模型中发现，视网膜小胶质细胞大量增殖并迁移至神经纤维层和节细胞层，这与Müller细胞中Cx43半通道激活并释放ATP密切相关。

房水分泌和引流的平衡调节是控制青光眼的主要手段[28]。缝隙连接介导的睫状体上皮跨细胞离子转运被认为是房水主动分泌的动力之一[29]。研究发现，小鼠睫状体色素上皮细胞中Cx43表达受Nectin信号通路调控，Cx43稳定表达可以促进房水分泌并维持眼内压[30]。敲除Cx43基因使小鼠睫状体无色素上皮和虹膜中的Cx43部分失活后，色素上皮和无色素上皮之间出现扩张，眼压显著降低[31]。Cx43在正常小梁网组织中稳定表达，Yu等[32]在小鼠前房注射缝隙连接通道抑制剂甘珀酸或氟芬那酸，发现抑制GJs可以导致房水流出阻力增加和眼压升高。

2.4Cx43与DR 正常条件下，Cx43在视网膜血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、Müller细胞和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中表达丰富[33]。研究发现，Cx43可以通过介导视网膜神经血管异常改变、炎症反应、氧化应激、EMT等过程参与DR。

Cx43在正常小鼠视网膜毛细血管和供血动脉之间沿着内皮细胞连接呈线状表达，参与血管内皮细胞与周细胞之间的功能性偶联[34]。Tien等[35]通过研究糖尿病捐献眼的视网膜组织发现，Cx43表达下调伴随周细胞丢失和新生血管形成。同样，链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中，周细胞覆盖血管范围减小伴随Cx43表达下调[36]。Tien等[37]报道，大鼠玻璃体腔注射Cx43小干扰RNA抑制Cx43的表达可以促进血管内皮细胞凋亡和新生血管形成，并引起血管渗漏和视网膜增厚。研究发现，高糖环境下培养的血管内皮细胞或共培养的周细胞和Müller细胞中，Cx43表达下调并破坏了血管内皮细胞之间、周细胞和Müller细胞之间的GJIC，从而影响细胞活性[38-39]。此外，高糖还可以诱导大鼠视网膜血管内皮细胞中线粒体Cx43(mitochondria Cx43,mtCx43)表达水平降低，促进了线粒体的断裂和血管内皮细胞凋亡，而维持mtCx43水平能够减少血管内皮细胞的丢失[40]。

Mugisho等[41]研究发现，Cx43在增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者和DR动物模型Akimba小鼠的视网膜组织中表达增加，Liu等[42]也证实Cx43和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白在糖尿病小鼠视网膜和PDR患者纤维血管膜中表达显著增加。低氧状态下，小鼠视网膜星形胶质细胞中Cx43磷酸化增加导致细胞间偶联增加，促使细胞毒性分子从濒临死亡的星形胶质细胞中转移至其相邻的健康细胞，扩大了缺氧诱导的细胞毒性损害，严重破坏了视网膜血管定向生成所需要的星形胶质细胞网络支架，进而促进异常血管生长[43]。以上研究提示Cx43和星型胶质细胞在新生血管的形成中发挥重要作用。

炎症在DR病理过程中亦发挥重要作用。Mugisho等[44]采用高糖联合炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18处理人视网膜色素上皮细胞ARPE-19，发现与单纯炎症因子处理组相比，联合处理组的ARPE-19细胞中的IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1、可溶性黏附分子、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和ATP等因子的表达显著上调；而采用Cx43半通道阻滞剂Peptide5处理可明显减少炎症因子的表达和ATP释放，提示Cx43半通道开放扩大了DR病理过程中的炎症反应。Lyon等[45]研究发现高糖联合炎症因子IL-1β、IL-18处理可诱导ARPE-19细胞发生EMT，表现为细胞形态发生改变、闭锁小带蛋白1表达下降和α-平滑肌肌动蛋白表达上调，而应用Cx43半通道阻滞剂Tonabersat可阻遏EMT过程。研究发现，炎症因子和高糖可以促使ARPE-19细胞Cx43半通道开放并大量释放ATP，ATP促进炎症体复合物形成并增加IL-1β和VEGF的释放，这些促炎因子的释放可以进一步激活Cx43半通道开放，从而形成一个永存的自分泌反馈环[46]。

3 Cx43靶向药物与眼部疾病治疗

Cx43靶向药物主要包括三种，分别为Cx43模拟肽、Tonabersat和反义寡核苷酸(Antisense Oligodeoxynucleotides,AsODN)。

Cx43模拟肽包含以Cx43胞外环为靶点的Gap26、Gap27、Peptide 5和以Cx43 羧基末端为靶点的α羧基末端合成肽(alpha carboxyl-terminal peptides,αCT1)[47]。研究发现，Gap27可以加速离体人角膜伤口中巨噬细胞的浸润并促进角膜伤口愈合，而在活体大鼠角膜缝合模型中却发现，Gap27促进粒细胞浸润和炎症介质的释放，表明Gap27的促角膜愈合作用适用于浅表伤口，而不适用于深层角膜损伤[48]。应用Peptide 5抑制ARPE-19细胞的Cx43半通道后，可以下调高糖和炎症因子诱导的乳酸脱氢酶和ATP的释放，并阻止Cx43的内吞和降解，从而保护视网膜色素上皮外屏障的完整性[49]。在大鼠角膜创伤模型中，αCT1可以竞争性抑制Cx43与闭锁小带蛋白1结合从而降低Cx43的活性，减轻炎症反应并加快伤口愈合[50]。Obert等[51]采用激光光凝诱导小鼠脉络膜新生血管或强光暴露破坏小鼠视网膜外屏障后，给予αCT1滴眼液治疗，结果显示其不仅可以减少脉络膜新生血管的生成及渗漏，并且可以阻止强光损伤引起的RPE细胞形态紊乱，同时体外实验显示αCT1可以独立于Cx43稳定RPE细胞的紧密连接。Huang等[52]应用纳米颗粒来装载Cx43模拟肽并给予视网膜缺血大鼠模型玻璃体腔注射，持续释放的Cx43模拟肽可以抑制炎症反应，并防止缺血引起的视网膜变薄和视网膜血管破坏，有望应用于DR、青光眼等与视网膜缺血相关的眼病治疗中。

Tonabersat是一种新型苯并吡喃衍生物,其作用效果与Peptide 5类似。Tonabersat的优势主要在于它能够通过血脑屏障，故可以采用口服途径给药[46]，多项研究证实Tonabersat在DR病理过程中具有保护视网膜的结构和功能的重要作用，其安全性验证正在进行Ⅱ期临床试验[53]。最新研究发现，Tonabersat可以通过抑制炎症体途径减轻干性黄斑变性大鼠模型的炎症反应，并保护视网膜光感受器和双极细胞的功能[54]。

AsODN是由13～25个核苷酸组成的单链核酸，其碱基序列与目标基因RNA序列互补并特异性地结合形成双链结构，从而沉默靶基因[55]。兔青光眼小梁切除术模型中，结膜下注射Cx43 AsODN可以抑制结膜瘢痕形成和纤维化[56]。Grupcheva等[57]应用Cx43AsOSN处理大鼠机械刮伤角膜模型，发现AsODN减轻了角膜基质的水肿和炎症反应，更完整地修复角膜上皮基底层，从而显著提高了伤口的闭合率。Ormonde等[58]首次报道了5例应用Cx43 AsODN治疗严重眼表烧伤患者的前瞻性临床研究，结果显示Cx43 AsODN治疗1～2d后炎症反应明显减轻，最终5例患者均获得了完整、稳定的角膜上皮再生。目前，应用天然寡核苷酸Nexagon，CODA001治疗角膜上皮缺损的人类Ⅱ期临床试验研究正在进行中[59]。

4 展望

Cx43在维持眼组织正常结构和功能方面发挥多重关键作用，如参与角膜细胞稳态、晶状体代谢、眼内压维持、星型胶质细胞激活和视网膜血管调节等。Cx43表达异常或其介导的缝隙连接通道异常与角膜炎、白内障、青光眼、DR等常见致盲性眼病发生发展密切相关。探索以Cx43为靶点的药物有望为常见致盲性眼病的治疗提供崭新的方向。