激活CB2受体对MPP+诱导BV2小胶质细胞iNOS和Arg-1表达的影响

［摘要］ 目的 探讨激活大麻素Ⅱ型受体（CB2受体）对1－甲基－4－苯基吡啶离子（MPP+）处理的BV2小胶质细胞M1/M2表型转化的影响。

方法 培养BV2小胶质细胞，将其分为对照组、MPP+组、JWH133（CB2受体激动剂）＋MPP＋组、AM630（CB2受体抑制剂）＋MPP＋组、JWH133＋AM630＋MPP＋组。应用免疫印迹法检测各组诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶－1（Arg－1）蛋白的表达。

结果 与对照组相比，MPP+组BV2小胶质细胞iNOS蛋白表达明显上升（F=9.825，q=6.346，P＜0.01）；JWH133预处理抑制MPP+诱导的iNOS蛋白的上调（q=5.714，P＜0.01），此抑制作用可被AM630逆转（q=4.154，P＜0.05）。与MPP+组相比，JWH133预处理显著上调Arg－1蛋白表达水平（F=5.800，q=5.520，P＜0.01），此作用可被AM630所阻断（q=4.155，P＜0.05）。

结论

激活CB2受体可抑制MPP+处理的BV2小胶质细胞M1极化，并且促进BV2小胶质细胞从M1型转化为M2型。

［关键词］ 受体，大麻酚，CB2；大麻素受体激动剂；小神经胶质细胞；表型；一氧化氮合酶Ⅱ型；精氨酸酶

［中图分类号］ R338.2

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0195－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.022

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.0855.003.html;2023－03－03 16：37：49

帕金森病（PD）是一种以中脑黑质多巴胺能神经元进行性退化为特征的神经退行性疾病。神经炎症是PD的主要病理因素之一，小胶质细胞是参与调节神经炎症的重要细胞。研究表明，小胶质细胞分为经典激活型（M1型）和选择性激活型（M2型）。M1型小胶质细胞持续产生促炎递质，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素1β（IL－1β）等；M2型小胶质细胞分泌抗炎因子和神经营养因子，如精氨酸酶－1（Arg－1）、脑源性神经营养因子（BDNF）等。因此，有效调控小胶质细胞的表型状态，可能成为未来治疗PD的新策略。

近些年研究表明，大麻素Ⅱ型受体（CB2受体）主要分布在小胶质细胞上，激活CB2受体可以抑制小胶质细胞的激活，进而调节神经炎症。有研究报道，激活CB2受体可调节小胶质细胞M1/M2极化，进而减轻出血性脑病的脑损伤。然而，激活CB2受体对1－甲基－4－苯基吡啶离子（MPP+）处理的小胶质细胞表型影响目前尚不清楚。本研究应用MPP+处理BV2小胶质细胞建立体外PD模型，观察CB2受体激动剂JWH133对MPP＋诱导的BV2细胞不同表型标志物iNOS和Arg－1表达的影响，以及CB2受体拮抗剂AM630的阻断效应。

1 材料和方法

1.1 实验材料

BV2小胶质细胞购于中国科学院上海细胞库；DMEM高糖培养液和胎牛血清购自以色列Biological Industries（BI）公司；青霉素/链霉素溶液购自索莱宝公司；MPP+、CB2受体激动剂JWH133和CB2受体抑制剂AM630购自美国Sigma－Aldrich公司；兔抗iNOS和β－actin抗体购自美国Proteintech公司；兔抗Arg－1抗体购自美国Cell Signaling公司；HRP标记山羊抗兔IgG购自中国爱必信公司；ECL发光液购于中国雅酶公司。

1.2 细胞培养及分组

BV2小胶质细胞用DMEM高糖培养液进行培养，该培养液中含有体积分数0.10的胎牛血清和体积分数0.01的青霉素/链霉素。细胞置于温度为37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养。细胞培养2～3 d后进行传代，将状态良好的细胞接种于六孔板中，进行下一步实验。将BV2细胞分为对照组（A组）、MPP＋组（B组）、JWH133＋MPP＋组（C组）、AM630＋MPP＋组（D组）以及JWH133＋AM630＋MPP＋组（E组）。A组不做任何处理；B组使用200 μmol/L的MPP+处理小胶质细胞24 h；C组先加入1 μmol/L的JWH133预处理小胶质细胞40 min，再加入200 μmol/L的MPP+共处理细胞24 h；D组先加入1 μmol/L的AM630预处理小胶质细胞40 min，再加入200 μmol/L MPP+共处理细胞24 h；E组同时使用1 μmol/L的JWH133和1 μmol/L的AM630预处理细胞40 min，再加入200 μmol/L MPP+共处理细胞24 h。

1.3 免疫印迹法检测iNOS和Arg－1蛋白的表达

各组BV2小胶质细胞经过药物处理后，用PBS洗涤3次，每孔加入100 μL RIPA裂解缓冲液冰上裂解30 min。

用刮板将细胞刮下，经离心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）提取细胞蛋白。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将含有20 μg蛋白质的样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，

随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜放进50 g/L 脱脂牛奶中，室温封闭2 h，分别加入iNOS（1∶2 000）、Arg－1（1∶1 000）和β－actin（1∶5 000）一抗4 ℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG（1∶10 000）二抗室温孵育1 h。应用ECL发光液显影，然后使用Image J软件分析iNOS和Arg－1蛋白表达。

1.4 统计学分析

应用Graphpad Prism 7.0软件进行统计学分析，实验数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析（One－way ANOVA），然后采用Turkey法进行组间两两比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 JWH133对MPP+处理的小胶质细胞iNOS蛋白表达的影响

与对照组相比较，MPP+组BV2小胶质细胞iNOS蛋白表达水平显著增加，差异具有统计意义（F=9.825，q=6.346，P＜0.01）；与MPP+组比较，JWH133＋MPP＋组iNOS蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义（q=5.714，P＜0.01）；而JWH133的作用可以被AM630逆转，JWH133＋AM630＋MPP＋组BV2小胶质细胞iNOS蛋白的表达水平较JWH133＋MPP＋组有所上调，差异具有统计学意义（q=4.154，P＜0.05）。见表1。

2.2 JWH133对MPP+处理的小胶质细胞Arg－1蛋白表达的影响

与MPP+组相比较，JWH133＋MPP＋组BV2小胶质细胞Arg－1蛋白的表达水平显著上调，差异具有统计学意义（F=5.800，q=5.520， P＜0.01）；而JWH133＋AM630＋MPP＋组BV2小胶质细胞Arg－1蛋白的表达水平较JWH133＋MPP＋组有所下降，差异具有统计学意义（q=4.155，P＜0.05）。见表1。

3 讨 论

PD是全球第二常见的神经退行性疾病，其典型的临床症状有静止性震颤、姿势不稳、运动迟缓和肌僵直等。PD发病过程中，伴随着过度的氧化应激和神经炎症等病理改变，导致黑质多巴胺能神经元进行性丢失。目前，左旋多巴替代治疗是临床治疗PD的重要手段，但是却不能抑制PD的进展。因此，探究导致多巴胺能神经元死亡的确切机制，有针对性地寻找治疗靶点，是目前改善PD疗效的关键。神经炎症是促使PD进展的重要病理因素。TIWARI等发现，过度的神经炎症会破坏神经元。并且有研究表明，在PD病人的大脑黑质中，小胶质细胞被异常激活，从而诱发炎症反应。因此，小胶质细胞的激活可能是影响PD进展的重要因素之一。小胶质细胞具有高度可塑性的特征，活化的小胶质细胞会出现两种表型，包括促炎的M1型和抗炎的M2型。在神经退行性疾病中会伴随着慢性炎症，导致不同表型小胶质细胞的比例失衡。有研究报道，米诺环素能促进小胶质细胞M2极化，抑制M1极化，有助于神经元存活和神经功能恢复。现有观点认为，促进M1型小胶质细胞转化为M2型可改善周围神经元的炎症，进而发挥神经保护作用。

近年来，越来越多的研究证实，大麻素具有神经保护和调节运动的功能。有体外实验研究表明，Δ9四氢大麻二醇（Δ9－THC）能抵抗1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）诱导的细胞毒作用，可能是治疗PD的有前途的药物。而大麻素的生理效应主要是由大麻素Ⅰ型受体（CB1受体）和CB2受体介导的。其中CB2受体主要在胶质细胞中表达，研究表明，存在慢性炎症的大脑组织中，CB2受体聚集于激活的小胶质细胞中。CB2受体敲除的小鼠大脑中，神经炎症水平明显升高。现有观点认为，CB2受体的神经保护作用是由于其对小胶质细胞表型的影响，激活CB2受体促进小胶质细胞由具有神经损伤作用的M1型转化为具有神经保护作用的M2型。本研究应用MPP+制备体外PD模型，探究激活CB2受体对BV2小胶质细胞表型的影响。结果显示，MPP+处理的BV2小胶质细胞iNOS蛋白表达显著增加，表明BV2小胶质细胞主要为M1型；CB2受体激动剂JWH133预处理可抑制MPP+诱导的iNOS蛋白表达上调，表明激活CB2受体对M1型小胶质细胞具有抑制作用。进一步使用CB2受体抑制剂AM630进行验证，结果显示JWH133的作用被阻断。此外，MPP+处理的小胶质细胞Arg－1蛋白表达与对照组比较无明显变化。推测产生该现象的原因是：①MPP+是具有神经毒性的药物，可刺激小胶质细胞释放大量的炎症因子，对于抗炎因子Arg－1的释放无直接作用；②小胶质细胞为了应对MPP+的毒性刺激产生了自我抗炎的保护作用，从而使Arg－1的水平保持不变；③MPP+对M1型小胶质细胞的影响更显著，本实验中MPP+的用量可能对M2型小胶质细胞未产生明显的影响。本文研究结果与之前的有关研究结果一致。本文结果还显示，JWH133预处理显著上调Arg－1蛋白表达水平，表明激活CB2受体促进BV2小胶质细胞由M1型向M2型转化，而该作用可以被AM630逆转。

综上所述，JWH133激活CB2受体可以抑制MPP+处理的BV2小胶质细胞M1极化，同时促进BV2小胶质细胞从M1型向M2型转化。本文结果为以激活CB2受体调节小胶质细胞表型转化作为靶点的PD治疗提供了实验基础，但是CB2受体对小胶质细胞表型的调节作用仍未明确。有研究表明，JWH133通过核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO－1）通路改善促炎M1巨噬细胞极化，从而显示出抗肥胖炎症作用。另外有研究表明，JWH133可通过环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）途径促进小胶质细胞M2极化，参与生发基质出血诱导后CB2受体介导的抗炎作用。因此，JWH133对MPP+诱导的小胶质细胞表型调节作用可能也与cAMP/PKA或者Nrf2/HO－1通路相关，但具体的机制通路仍需要进一步研究。

［参考文献］

FORNO L S. Neuropathology of Parkinson’s disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology， 1996，55（3）：259－272.

SKAPER S D， GIUSTI P， FACCI L. Microglia and mast cells： two tracks on the road to neuroinflammation. The FASEB Journal， 2012，26（8）：3103－3117.

BENSON M J， MANZANERO S， BORGES K. Complex alterations in microglial M1/M2 markers during the development of epilepsy in two mouse models. Epilepsia， 2015，56（6）：895－905.

SUGAMA S， TAKENOUCHI T， CHO B P， et al. Possible roles of microglial cells for neurotoxicity in clinical neurodege－nerative diseases and experimental animal models. Inflammation amp; Allergy Drug Targets， 2009，8（4）：277－284.

MARTINEZ F O， GORDON S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation： time for reassessment. F1000prime Reports， 2014，6：13.

WALTER L， STELLA N. Cannabinoids and neuroinflammation. British Journal of Pharmacology， 2004，141（5）：775－785.

LISBOA S F， GOMES F V， GUIMARAES F S， et al. Microglial cells as a link between cannabinoids and the immune hypothesis of psychiatric disorders. Frontiers in Neurology， 2016，7：5.

TAO Y H， LI L， JIANG B， et al. Cannabinoid receptor－2 stimulation suppresses neuroinflammation by regulating microglial M1/M2 polarization through the cAMP/PKA pathway in an experimental GMH rat model. Brain， Behavior， and Immunity， 2016，58：118－129.

BRAAK H， RB U， DEL TREDICI K. Cognitive decline correlates with neuropathological stage in Parkinson’s disease. Journal of the Neurological Sciences， 2006，248（1－2）：255－258.

MORE S V， CHOI D K. Promising cannabinoid－based therapies for Parkinson’s disease： motor symptoms to neuroprotection. Molecular Neurodegeneration， 2015，10：17.

UTSUMI H， OKUMA Y， KANO O， et al. Evaluation of the efficacy of pramipexole for treating levodopa－induced dyskinesia in patients with Parkinson’s disease. Internal Medicine （Tokyo， Japan）， 2013，52（3）：325－332.

HIRSCH E C， HUNOT S. Neuroinflammation in Parkinson’s disease： a target for neuroprotection The Lancet Neurology， 2009，8（4）：382－397.

TIWARI P C， PAL R. The potential role of neuroinflammation and transcription factors in Parkinson disease. Dialogues in Clinical Neuroscience， 2017，19（1）：71－80.

MORE S V， KUMAR H， KIM I S， et al. Cellular and mole－

cular mediators of neuroinflammation in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Mediators of Inflammation， 2013，2013：952375.

MALEK N， POPIOLEK－BARCZYK K， MIKA J， et al. Anandamide， acting via CB2 receptors， alleviates LPS－induced neuroinflammation in rat primary microglial cultures. Neural Plasticity， 2015，2015：130639.

LU Y N， ZHOU M M， LI Y， et al. Minocycline promotes functional recovery in ischemic stroke by modulating microglia polarization through STAT1/STAT6 pathways. Biochemical Pharmacology， 2021，186：114464.

ZEISSLER M L， EASTWOOD J， MCCORRY K， et al. Delta－9－tetrahydrocannabinol protects against MPP+ toxicity in SH－SY5Y cells by restoring proteins involved in mitochondrial biogenesis. Oncotarget， 2016，7（29）：46603－46614.

CRISTINO L， BISOGNO T， DI MARZO V. Cannabinoids and the expanded endocannabinoid system in neurological di－

sorders. Nature Reviews Neurology， 2020，16（1）：9－29.

CASTILLO P E， YOUNTS T J， CHVEZ A E， et al. Endocannabinoid signaling and synaptic function. Neuron， 2012，76（1）：70－81.

TERNIANOV A， PREZ－ORTIZ J M， SOLESIO M E， et al. Overexpression of CB2 cannabinoid receptors results in neuroprotection against behavioral and neurochemical alterations induced by intracaudate administration of 6－hydroxydopamine. Neurobiology of Aging， 2012，33（2）：421.e1－421.16.

BENITO C， NEZ E， TOLN R M， et al. Cannabinoid CB2 receptors and fatty acid amide hydrolase are selectively overexpressed in neuritic plaque－associated glia in Alzheimer’s disease brains. The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2003，23（35）：11136－11141.

JAVED H， AZIMULLAH S， HAQUE M E， et al. Cannabinoid type 2 （CB2） receptors activation protects against oxidative stress and neuroinflammation associated dopaminergic neurodegeneration in rotenone model of Parkinson’s disease. Frontiers in Neuroscience， 2016，10：321.

KLEGERIS A， BISSONNETTE C J， MCGEER P L. Reduction of human monocytic cell neurotoxicity and cytokine secretion by ligands of the cannabinoid－type CB2 receptor. British Journal of Pharmacology， 2003，139（4）：775－786.

STELLA N. Cannabinoid and cannabinoid－like receptors in microglia， astrocytes， and astrocytomas. Glia， 2010，58（9）：1017－1030.

黄河灵，高玉元，聂坤，等. 巨噬细胞移动抑制因子介导MPP+/MPTP诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活. 南方医科大学学报， 2021，41（7）：972－979.

ZHOU P， WENG R H， CHEN Z Y， et al. TLR4 signaling in MPP+－induced activation of BV－2 cells. Neural Plasticity， 2016，2016：5076740.

MA L， JIA J， LIU X Y， et al. Activation of murine microglial N9 cells is attenuated through cannabinoid receptor CB2 signaling. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015，458（1）：92－97.

WU Q， MA Y N， LIU Y， et al. CB2R agonist JWH－133 attenuates chronic inflammation by restraining M1 macrophage polarization via Nrf2/HO－1 pathway in diet－induced obese mice. Life Sciences， 2020，260：118424.

（本文编辑 马伟平）