HBV相关性肾炎患者肾组织氧化应激指标SOD、HO-1、8-OHdG的表达及临床意义

金珍杰 何平

氧化应激是机体面对各种有害刺激时所作出的应激反应，机体内氧化系统与抗氧化系统失去平衡，产生大量的氧化应激产物在体内大量蓄积。这些产物称之为活性氧族（reactive oxygen species，ROS），ROS 主要包括超氧阴离子、过氧化物、羟自由基等。ROS 主要产生于还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶途径及线粒体途径，其中超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）可以清除体内的氧自由基；血红素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）是在肾小管细胞中合成的一种酶，是对氧化应激反应最强烈的酶之一，具有保护、抗炎作用；8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）是比较敏感的氧化应激损伤下DNA 损害的生物标志物。在正常生理状态下，人体内存在较低水平的ROS，不会对机体造成损害，但在氧化应激状态下，组织细胞产生过量的ROS 就会影响人体的重要物质如核酸、碳水化合物、蛋白质、脂肪以及其他分子的代谢，从而损害细胞的结构及功能，对机体造成损害[1-2]。

我国人群HBV 携带率较高[3]，HBV 相关性肾炎（hepatitis B virus associated glomerulonephritis，HBVGN）是HBV 引起的肾脏继发性损伤[4]。乙肝患者中的HBV-GN 发生率达8%～20%[5]。目前HBV-GN 的诊断标准为：（1）血清HBV 抗原阳性；（2）患者有肾小球肾炎，并且能够除外狼疮性肾炎等其他一些继发性的肾小球疾病；（3）肾组织病理切片中能够找到HBV 抗原。其中（2）（3）为诊断的必要条件。目前，氧化应激与HBV-GN 发生、发展的关系研究不多。本研究旨在探讨氧化应激指标在HBV-GN 组织中的表达情况，分析氧化应激指标与HBV-GN 发生、发展的关系，以期为HBV-GN 的诊疗提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010 至2019 年中国医科大学附属盛京医院收治的HBV-GN 患者18 例，为观察组。患者均在B 超引导下行经皮肾穿刺活检术，行组织学、免疫组化或免疫荧光及超微病理学检查确诊，且排除狼疮性肾炎等其他继发性肾小球肾炎疾病。观察组患者男14 例，女4 例；年龄24～66（40.44±9.32）岁；留取患者肾组织石蜡切片为研究材料。另择2011 至2019 年本院收治的因肾脏肿瘤或外伤行肾组织切除术患者25 例，排除其他肾脏疾病，为对照组。对照组患者男18 例，女7 例；年龄30～60（44.28±10.26）岁；留取切除的距病灶最远端的切缘肾组织标本为研究材料。两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 患者肾功能指标检测 患者首次入院时检测24 h 尿蛋白、肾小球滤过率、血清肌酐、尿素氮水平等肾功能指标。其中24 h 尿蛋白为患者进行肾脏穿刺活检前3 次24 h 尿蛋白的平均水平，其余均为清晨空腹状态下所采集的静脉血液检测值。

1.2.2 患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平免疫组化检测

1.2.2.1 试剂和仪器 兔抗人SOD、HO-1、8-OHdG单克隆抗体均购自北京中杉金桥公司；DBA试剂盒、免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥公司。抗原修复液配制：柠檬酸钠0.4 g 及柠檬酸三钠3 g 加入1 000 ml PBS 液中。显微镜（日本尼康公司，型号E 800）；图像采集软件Nis-Elements F 3.0；图像分析软件Nis-Elements Br-3.0。

1.2.2.2 检测方法 将肾组织石蜡切片于PBS 液中浸泡5 min，然后脱蜡至水，再于柠檬酸-柠檬酸钠抗原修复液中微波抗原修复7.5 min；室温下自然冷却；PBS冲洗5 min×2 次；加入过氧化氢，室温下放置45 min；PBS 冲洗5 min×2 次；加入山羊血清封闭抗原，室温下放置45 min，分别加入兔抗人SOD 单克隆抗体（1∶800）、兔抗人HO-1 单克隆抗体（1∶800）、兔抗人8-OHdG 单克隆抗体（1∶800）于切片；4 ℃冰箱放置12 h；室温下复温10 min；PBS 液冲洗5 min×2，加入二抗试剂1 放置20 min，PBS 冲洗5 min×2 次；加入二抗试剂2（辣根过氧化物酶标记），放置20 min，PBS 冲洗5 min×2，DBA 显色，苏木素复染，流水返蓝，脱水透明，树胶封片；以PBS 取代一抗作为阴性对照。分别于200 倍及400 倍显微镜下观察，并使用图像分析软件进行半定量分析。

1.3 观察指标 （1）观察两组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达镜下所见；（2）比较两组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平；（3）分析观察组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平与肾功能指标的相关性。

2 结果

2.1 两组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达镜下所见 见图1、2、3（插页）。

图1 两组患者肾组织SOD 表达镜下所见（A：观察组；B：对照组；免疫组化染色，×400）

图2 两组患者肾组织HO-1 表达镜下所见（A：观察组；B：对照组；免疫组化染色，×400）

图3 两组患者肾组织8-OHdG 表达镜下所见（A：观察组；B：对照组；免疫组化染色，×400）

2.2 两组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平比较 两组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），观察组肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 水平均明显高于对照组，见表1。

表1 两组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平比较

2.3 观察组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平与肾功能指标的相关性 观察组患者24 h 尿蛋白定量、肾小球滤过率、血清肌酐、尿素氮水平分别为（4.79±2.44）g、（95.51±23.39）ml·min-1·1.73 m-2、（86.32±28.10）μmmol/L、（5.94±1.76）mmol/L。相关性分析显示，观察组患者肾组织HO-1 表达水平与肾小球滤过率呈正相关（r=0.667，P＜0.05），其余指标间均无相关性（均P＞0.05）。见表2。

表2 观察组患者肾组织SOD、HO-1、8-OHdG 表达水平与肾功能指标的相关性

3 讨论

本研究结果显示，观察组患者肾组织氧化应激指标HO-1、SOD、8-OHdG 表达水平均明显高于对照组。即氧化应激与HBV-GN 的发生、发展密切相关。我国乙肝患者较多，HBV-GN 也较多，HBV-GN 患者临床表现复杂多样，以肾病综合征最常见[6]。一种临床表现可能有很多种的病理类型，同样，一种病理类型也可有多种临床表现[7]。目前研究表明其发病机制可能包括一下4 种：（1）HBV 抗原和其抗体形成的免疫复合物沉积于肾脏，并且能够激活补体从而造成免疫损伤；（2）HBV 直接感染肾脏细胞；（3）机体的免疫系统功能发生异常；（4）遗传和一些社会因素等。普遍认为，病毒直接感染肾脏细胞是HBV-GN的主要发病机制，但其具体发病机制仍不明确[8]。目前，HBV-GN 治疗方案尚未统一，临床常用的药物有干扰素、核苷类似物、激素、免疫抑制剂、钙神经蛋白抑制剂及中医中药治疗等，HBV-GN 治疗方案个体性非常强，且治疗效果不确切。本研究发现氧化应激与HBV-GN 发生、发展有关，或可为其治疗提供更多思路。

本研究还发现，HBV-GN 患者肾组织HO-1 表达水平与肾小球滤过率呈正相关，随着肾组织HO-1的表达增强，肾小球滤过率增高，提示HO-1 的表达升高有利于改善肾脏功能。HO-1 是一种抗氧化剂，是血红素降解的限速酶之一，广泛分布于哺乳动物的多种细胞中，它可以可促进血红素产生胆绿素、CO、游离铁等[9]，产生的这些物质具有一定的抗氧化、抗炎等作用。在细胞水平上，HO-1 还可以调控含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的表达及凋亡标志物p38 信号传导[10]。有研究发现，在肾间质纤维化的动物模型试验中，随着HO-1 的表达升高，能够引起单核细胞趋化蛋白-1 及转化生长因子β1 表达降低，而TGF-β1 在肾间质纤维化形成过程中起重要的作用，而且它还可以促进炎症细胞的产生，从而对肾脏造成损害[11]。Correa-Costa 等[12]发现HO-1 的高表达能够逆转肾间质纤维化；而肾脏出现间质纤维化会损伤肾脏功能，从而出现肾小球滤过率的下降。由此可知HO-1 可以通过降低TGF-β1 的表达，抑制细胞外基质的异常过度增生，抑制肾间质纤维化的发生、发展[13]。由此可见，HO-1 通过降低肾间质纤维化维持肾脏功能，目前关于H0-1 与肾脏疾病的研究较多，且有的已应用于临床。

目前一些抗氧化剂对一些其他类型的肾脏疾病的治疗有大量研究。如Subramanian 等[14]研究橙皮苷（一种生物类黄酮）可以清除自由基，抑制炎症反应，上调通过转录因子Nrf2 介导的抗氧化反应元件来上调HO-1，促进抗氧化系统来抑制庆大霉素诱导的大鼠肾脏毒性。Abdullah 等[15]研究表明磷酸肌酸的体内外肾脏保护作用依赖于通过蛋白调节激酶介导的Nrf-2/HO-1 通路抑制细胞凋亡和ROS 生成，提示磷酸肌酸可能成为糖尿病肾病治疗的一种新的治疗候选。治疗肾脏疾病的常用药物雷公藤的有效成分雷公藤甲素对于Nrf-2/HO-1 通路也有一定的激活作用，目前其对于心脏方面的治疗已有研究[16]。还有研究发现普罗布考、硫辛酸可减轻氧化应激，从而改善肾脏足细胞损伤[17]，前列地尔、α-酮酸等对于氧化应激也有一定的作用。

综上所述，氧化应激指标SOD、HO-1、8-OHdG 在HBV-GN 患者肾组织中表达增强，与疾病的发生、发展有关。且HBV-GN 患者肾组织HO-1 表达水平与肾小球滤过率呈正相关。