γ射线、电子束辐照处理对芦苇木质纤维素结构及酶解性能的影响

陈 亮 武小芬 齐 慧 王丹阳 刘 安 邓 明 王克勤，*

（1湖南省农业科学院/湖南省核农学与航天育种研究所/湖南省农业生物辐照工程技术研究中心/生物辐照技术湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410125；2湖南大学隆平分院，湖南 长沙 410125）

芦苇（Phragmites australis）属禾本科多年生草本植物，在我国分布广泛，多集中生长在草甸与湿地，容易收集储运，具有抗旱、耐渍、纤维素含量与生物学产量高、不与粮食作物争地的特点［1-2］，是生物炼制的优质原料。

预处理是木质纤维素生物炼制的一道关键工序，目的是破坏植物在长期生长进化过程中形成的“抗生物降解屏障”，提高纤维素的生物转化效率［3-4］。目前常用的预处理方法有化学法、物理法、生物法等，但上述预处理方法都存在不足，如化学预处理有环境污染风险，物理预处理能耗高，生物预处理效率低［5-6］，因此预处理仍是制约木质纤维素生物炼制产业化的技术瓶颈［7］。射线辐照预处理已经被证明是一种有效的预处理手段，能大幅度提高木质纤维素的生物转化效率，如采用800 kGy γ射线辐照预处理的水稻秸秆，其纤维素的酶解转化率可由12.8%提高到64.1%［8］，而且射线预处理过程简便，不需要化学品及水的参与，对环境影响小，在木质纤维素处理上具有独特优势。

但由于γ 射线和电子束的能量来源不同，导致两种射线与物质之间的作用机理不同。如γ射线辐照利用γ光子（1.17、1.33 MeV）与物质发生作用，主要产生光电效应、康谱顿效应和电子对效应，电子束辐照则是带电粒子与物质发生作用，主要产生电离、激发和散射等效应［9-10］。在辐照加工过程中，这两种射线对作用对象的影响也不同，γ 射线具有更强的氧化性，而电子束在辐照过程中可能存在还原效应［11］；γ 射线穿透性好，而电子束的穿透性较差［12］。在木质纤维素预处理上，尽管有许多研究表明射线辐照预处理对于木质纤维素的酶解转化有明显促进作用，如Yang等［13］发现经过500 kGy γ 射线辐照的小麦秸秆纤维素酶解转化率为13.40%，较对照提高了4.77 个百分点；Bak 等［14］发现经过80 kGy 电子束辐照的水稻秸秆纤维素酶解转化率为52.1%，是对照的2.3 倍，但由于不同研究者采用的射线和木质纤维素原料都不相同，难以准确评价γ 射线和电子束辐照预处理木质纤维素效果的差异，因此采用γ射线和电子束两种射线辐照处理同一种木质纤维素材料，分析辐照后木质纤维素结构与酶解性能的变化，旨在为辐照加工技术应用于木质纤维素预处理提供更准确的数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦苇收集自湖南省沅江市，自然晾干，水分约10%。

纤维素酶Celluclast 1.5 L，诺维信（中国）生物技术有限公司（天津）；乙酸、乙酸钠、硫酸、溴化钾，国药集团化学试剂有限公司（上海）；葡萄糖、木糖标准品，Sigma公司（美国）。

1.2 仪器与设备

HZQ-F100 恒温摇床，常州诺基仪器有限公司；YSQ-LS-50S11 立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BlueStar A 紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；Nicolet iS5 红外光谱仪、Ulti Mate 3000 高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；JSM-6380LV 扫描电镜光谱仪，日本电子株式会社；Rigaku D/max 2500 X-射线衍射仪，日本理学株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 芦苇辐照预处理 γ 射线辐照在湖南省核农学与航天育种研究所进行，辐射源强度约为2.96×1016Bq，平均剂量率约149 Gy·min-1。电子束辐照在河北速能辐射加工有限公司进行，电子束能量为5 MeV，平均剂量率约20 kGy·s-1。辐照在室温和自然空气条件下进行，吸收剂量约为200、300、400、500 kGy，以未辐照芦苇为对照（CK）。

1.3.2 芦苇主要成分分析 水溶性组分及水溶性糖类含量测定：称取一定量样品（精确至0.000 1 g），按固液比1∶30（m/v）加入蒸馏水，在50 ℃、130 r·min-1的摇床中震荡提取2 h后进行抽滤，滤渣采用90 mL 蒸馏水分3 次冲洗后在105 ℃条件下烘干至恒重。水溶性组分含量计算公式如下：

水溶性组分=［（M1-M2）/M1］×100%

式中，M1：样品绝干质量，g；M2：水洗后残渣绝干质量，g。

收 集 滤 液，用3，5-二 硝 基 水 杨 酸 法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）测定还原糖含量；参考文献［15］采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定葡萄糖、木糖含量；加入硫酸至硫酸浓度为3%后在121 ℃下水解1 h，用HPLC 再次测定葡萄糖、木糖含量，水溶性葡聚糖、木聚糖含量计算公式如下：

式中，m3：水解前葡萄糖质量，mg；m4：水解后葡萄糖质量，mg；m5：水解前木糖质量，mg；m6：水解后木糖质量，mg。

纤维素、半纤维素和木质素含量测定参照美国可再生能源实验室的标准分析方法［16］：在干燥后的滤渣中加入72%的硫酸，30 ℃水浴反应1 h，每5～10 min 振摇1 次，然后调节硫酸浓度至3%左右，高压灭菌锅内121 ℃反应1 h后过滤，滤渣于105 ℃烘干至恒重，得到酸不溶性木质素；滤液定容后采用HPLC 测定葡萄糖和木糖含量，320 nm 波长下测定酸溶性木质素含量，葡聚糖、木聚糖和木质素含量计算公式如下：

式中，m7：葡萄糖质量，g；m8：木糖质量，g；m9：酸溶性木质素质量g；m10：酸不溶性木质素质量，g；M3：残渣水洗前绝干质量，g。

1.3.3 芦苇结构分析

1.3.3.1 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析 将样品在60 ℃条件下干燥24 h，用双面胶将样品粘在载物盘上进行镀金处理，采用扫描电镜光谱仪进行观察，加速电压1.0 kV。

1.3.3.2 傅里叶红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析 样品于60 ℃条件下干燥24 h，取适量样品加入干燥的溴化钾（样品与溴化钾比值约为1∶100 质量比），在玛瑙研钵中充分研磨混和均匀后压片，进行红外光谱分析。

1.3.3.3 X 射线衍射（diffraction of X-rays，XRD）分析 取适量芦苇木质纤维素于研钵内，研磨至手摸无颗粒感，用X-射线衍射仪测定衍射强度。结晶指数（crystallinity index，CrI）参照下式计算［17］：

式中，Iam为无定形背景峰的衍射强度，一般为18°左右；I002为（002）晶面衍射峰强度，一般为22°左右。

1.3.4 芦苇酶水解 称取一定量芦苇木质纤维素于50 mL 三角瓶，按1∶10 固液比（m/v）加入pH 值4.8 的乙酸乙酸钠缓冲液，加入7.5 FPU·g-1底物的纤维素酶，分别在50 ℃、130 r·min-1的摇床中酶解6、24、48、72、96 h 取样离心，取上清液稀释、过膜后用HPLC 测定水解液中葡萄糖和木糖含量，葡聚糖和木聚糖转化率计算公式如下：

式中，Wglucose、Wxylose分别为酶解过程中产生的葡萄糖和木糖的质量，g；Wglucan、Wxylan分别为样品辐照前葡聚糖和木聚糖质量，g。

1.4 数据处理

所有测定均采用2次重复，采用Excel 2010进行数据分析，采用Origin 8.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 γ 射线、电子束辐照对芦苇木质纤维素主要化学组分含量的影响

由表1 可知，经过γ 射线、电子束辐照处理的芦苇水溶性组分含量随着吸收剂量的增加而增加，当吸收剂量在200～400 kGy 时，水溶性组分含量增加较缓慢，当吸收剂量为400 kGy时，经γ射线和电子束辐照的芦苇的水溶性组分含量分别是CK 的1.56 和1.52 倍，当吸收剂量为500 kGy时，经γ射线和电子束辐照的芦苇的水溶性组分含量均有较大幅度增加，分别是CK 的2.44 和1.98 倍。对芦苇纤维素、半纤维素、木质素含量分别进行测定发现，随着吸收剂量增加，经过γ 射线、电子束辐照处理的芦苇纤维素、半纤维素含量均逐渐下降。当吸收剂量为500 kGy时，经γ射线和电子束辐照的芦苇纤维素含量较CK 分别下降了1.44、1.50个百分点，半纤维素含量较CK 分别下降了2.86、2.58个百分点，而芦苇木质素含量变化均不显著，说明木质素对辐照耐受性最好，纤维素次之，半纤维素最容易被降解。通过对可溶物进行分析，发现经过γ射线、电子束辐照处理的芦苇水浸提物中还原糖、葡聚糖、木聚糖含量均随吸收剂量的提高而增加。当吸收剂量为500 kGy时，经γ射线辐照的芦苇水浸提物中还原糖、葡聚糖、木聚糖含量分别较CK 增加了2.08、3.46和6.85 倍，经电子束辐照的芦苇水浸提物中还原糖、葡聚糖、木聚糖含量分别较CK 增加了1.81、3.10、6.44倍。

表1 吸收剂量对芦苇木质纤维素主要化学组分含量的影响Table1 Effect of dose on the main chemical components content of PAL

由表2 可知，在试验剂量范围内，经过相同剂量γ射线和电子束辐照处理的芦苇木质纤维素的水溶性组分、纤维素、半纤维素、木质素含量均无显著差异。当吸收剂量为200和300 kGy时，经过电子束辐照的芦苇木质纤维素的水溶性还原糖含量显著高于γ 射线，当吸收剂量为400 kGy 时，两种射线之间无显著差异，当吸收剂量继续增加至500 kGy时，经过γ射线辐照的芦苇木质纤维素水溶性还原糖含量显著高于电子束。

表2 射线类型对芦苇木质纤维素主要化学组分含量的影响Table2 Effect of ray type on the main chemical components content of PAL

2.2 γ 射线、电子束辐照对芦苇木质纤维素物理化学结构的影响

2.2.1 SEM 分析 CK 和不同剂量辐照处理后的芦苇木质纤维素表观结构变化如图1 所示。CK 的芦苇木质纤维素表面较为光滑平整，裂缝和碎片较少，经过200 和300 kGy γ 射线和电子束辐照处理的芦苇木质纤维素表观结构变化均不明显，表面结构仍然较完整，但当吸收剂量达到400 kGy 时，γ 射线和电子束辐照处理的芦苇木质纤维素裂缝和碎片明显增加，鳞片状分裂和剥落现象发生在木质纤维素表面，使表面粗糙不均匀，表明芦苇木质纤维素微观结构受到破坏。辐照对芦苇木质纤维素微观结构的破坏有利于纤维素酶与芦苇纤维素充分接触，对于提高芦苇纤维素的水解率具有积极作用。

图1 芦苇木质纤维素辐照前后的SEMFig.1 SEM of PAL before and after irradiation treatment

2.2.2 FT-IR 分析 图2-A、C 分别是不同剂量γ 射线和电子束辐照处理后芦苇木质纤维素的FT-IR 光谱，图2-B、D 则分别是γ 射线和电子束辐照后芦苇木质纤维素FT-IR 与CKFT-IR 吸光值之差形成的图谱。由图2-B、D 可知，经过γ 射线和电子束辐照处理后，纤维素特征吸收峰897、1 166 cm-1，半纤维素特征吸收峰1 736 cm-1，木质素特征吸收峰1 510 cm-1强度均较CK 减弱，说明γ 射线和电子束辐照使芦苇纤维素、半纤维素、木质素发生了降解，而分子内羟基（-OH）伸缩振动吸收峰3 438 cm-1则较CK 明显增加，表明芦苇木质纤维素体系中分子内氢键数量增加。

图2 芦苇木质纤维素辐照前后FT-IRFig.2 FT-IR of PAL before and after irradiation treatment

2.2.3 XRD 分析 纤维素是一种由结晶区和无定形区交错结合的超分子。纤维素晶区中的氢键网络和分子取向不同使纤维素具有六种不同晶型，分别为纤维素Ⅰ、Ⅱ、ⅢI、ⅢII、ⅣI、和Ⅳ，在不同条件下这些晶型可以互换，其中纤维素I 是天然纤维素的存在形式［18］。由图3 可知，经过γ 射线和电子束辐照的芦苇木质纤维素和CK 纤维素衍射峰均在2θ=15.0°、16.5°、22.5°附近，符合纤维素Ⅰ衍射特征［19］，说明辐照没有改变芦苇纤维素的晶型。由表3 可知，随着吸收剂量的增加，经过γ射线和电子束辐照后芦苇纤维素结晶指数均较CK 降低，说明经过辐照后，芦苇木质纤维素体系中结构均一紧密的结晶态纤维素比例下降。

表3 辐照前后芦苇纤维素结晶指数Table 3 CrI of PAL cellulose before and after irradiation treatment /%

图3 芦苇木质纤维素辐照前后XRDFig.3 XRD of PAL before and after irradiation treatment

2.3 γ 射线、电子束辐照对芦苇木质纤维素酶水解的影响

γ 射线和电子束辐照处理后芦苇纤维素和半纤维素酶解转化率如图4 所示。随着吸收剂量的增加，芦苇纤维素和半纤维素的酶解转化率都逐渐提高。经过500 kGy γ射线和电子束辐照的芦苇木质纤维素在酶解96 h后，纤维素酶解转化率分别为16.68%和18.84%，分别是未处理芦苇的2.32和2.62倍；半纤维素酶解转化率分别为21.38%和21.74%，分别是未处理芦苇的3.82 和3.88 倍。采用相同剂量的γ 射线和电子束辐照处理后，芦苇木质纤维素酶水解率之间的差异如表4 所示。相同剂量的γ 射线和电子束辐照处理后，芦苇木质纤维素的半纤维素酶解转化率无显著差异，在200～400 kGy剂量范围内，相同剂量的γ射线和电子束辐照处理后，芦苇木质纤维素的纤维素酶解转化率也无显著差异，当吸收剂量为500 kGy 时，经过电子束辐照的芦苇木质纤维素的纤维素酶解转化率显著高于γ射线。

表4 射线类型对芦苇木质纤维素酶解转化率的影响Table 4 Effect of ray type on the enzymatic conversion of PAL /%

图4 芦苇木质纤维素辐照前后的聚糖酶解转化率Fig.4 Glycan conversion rate of enzymatic hydrolysis for PAL treaed with irradiation

3 讨论

本研究通过对辐照前后芦苇木质纤维素组分测定发现，γ 射线、电子束辐照后的芦苇木质纤维素中纤维素、半纤维素含量降低，水溶性组分含量显著增加，说明射线辐照能使木质纤维素体系中的大分子降解为可溶性小分子。Fei 等［20］和齐慧等［21］分别在经电子束和γ 射线辐照的生物质中发现了类似现象。组分测定还发现，水溶性组分中低聚糖含量显著增加，进一步说明部分纤维素、半纤维素被降解为小分子聚糖，Wu 等［15］和Liu 等［22］在经γ 射线辐照处理的生物质中发现了类似现象。当吸收剂量由400 kGy 增加至500 kGy 时，经过γ 射线、电子束辐照后，除木质素外，芦苇木质纤维素的各组分含量均有较大幅度的变化，说明400 kGy可能是芦苇辐照处理的临界剂量。经过相同剂量γ射线、电子束辐照后的芦苇木质纤维素中纤维素、半纤维素、木质素含量以及水溶性组分含量之间无明显差异，说明相同剂量γ 射线、电子束辐照对芦苇木质纤维素“抗生物降解屏障”的破坏作用也比较接近。

结构表征进一步发现γ 射线、电子束辐照能破坏生物质的物理化学结构，SEM 分析结果表明，经过400 kGy γ 射线和电子束辐照后的芦苇微观结构被破坏，该现象可能与木质纤维素的部分大分子物质被降解有关［23］。FT-IR 分析结果表明，经过辐照的芦苇纤维素、半纤维素、木质素特征吸收峰强度都有所减弱，而分子内羟基（-OH）伸缩振动吸收峰则较CK 明显增加，可能与射线使分子断裂，形成了更多分子有关，但未像Liu 等［24］和Chen 等［25］在1 730 cm-1附近发现羰基C=O伸缩振动峰明显增强的现象，可能是本研究采用的吸收剂量较低，没有大量形成新的羰基。XRD 分析结果表明，辐照提高了纤维素非结晶区的比例，但在试验吸收剂量范围内没有改变纤维素的晶型，非结晶区的增加对酶与纤维素分子的充分接触有利，可能是射线辐照提高木质纤维素酶水解效率的原因之一，Kapoor 等［26］和周瑞敏等［27］也发现射线辐照能降低生物质纤维素结晶度，Xu等［28］在研究辐照处理甜高梁秸秆过程中同样发现12C6+离子束辐照未改变纤维素晶型，但周瑞敏等［27］在经超高剂量（＞1 MGy）辐照处理的生物质中发现，纤维素X 衍射峰峰位存在随吸收剂量增加而向小角方向位移的现象，因此超高剂量的辐照对生物质的影响有待进一步研究。

对辐照过的芦苇木质纤维素进行酶解后发现，γ射线和电子束辐照处理均能明显促进芦苇木质纤维素酶解转化，经过500 kGy γ射线和电子束辐照的芦苇木质纤维素在酶解96 h时的纤维素酶解转化率分别是未处理芦苇的2.32 和2.62 倍。射线辐照能够提高生物质的酶解转化效率，进一步说明射线能破坏由纤维素、半纤维素、木质素为主要组分的“抗生物降解屏障”，提高酶与底物接触的机率。在200～400 kGy 剂量范围内，经过同等剂量γ射线和电子束辐照的芦苇木质纤维素的纤维素、半纤维素酶解转化率之间无明显差异，当吸收剂量为500 kGy 时，经过电子束辐照的芦苇木质纤维素的纤维素酶解转化率显著高于γ 射线，说明电子束和γ射线辐照对芦苇木质纤维素“抗生物降解屏障”的破坏作用相当，甚至电子束更优。

木质纤维素辐照预处理通常需要较高的吸收剂量，采用传统γ 射线辐照处理耗时较长，成本高，而电子加速器的能量利用率、处理效率远高于γ 辐照装置［9，29］。因此当电子束辐照预处理木质纤维素的效果和γ 射线没有明显差异时，电子束处理能极大减少处理时间，节约处理成本，具有更大的应用潜力。随着电子加速器的不断更新，目前已有低、中、高能电子加速器广泛应用于辐照加工领域，不同能量电子加速器的能量利用率、加工效率又各有差异，本研究初步探明了不同能量电子束对木质纤维素的影响，可为辐照技术应用于木质纤维素提供更加详实的数据支撑。

4 结论

γ 射线和电子束辐照均能破坏芦苇木质纤维素表观结构，在不改变芦苇纤维素晶型的同时降低芦苇纤维素结晶度，使部分纤维素、半纤维素降解为水溶性低聚糖，提高芦苇纤维素、半纤维素的酶解转化率；在相同剂量下，γ射线和电子束对芦苇木质纤维素主要化学组分、物理化学结构的影响相似，在200～400 kGy 剂量范围内，同等吸收剂量γ 射线和电子束辐照对芦苇纤维素、半纤维素酶解转化的促进作用无明显差异，当吸收剂量为500 kGy 时，电子束辐照对芦苇纤维素酶解促进作用显著优于γ射线。