巨噬细胞极化调控颌骨再生的研究进展*

刘琨 罗新 李君 孟春秀 张玉珏 吕兆勇 刘凤珍 张彬

颌骨缺损通常源于肿瘤、创伤、炎症或先天畸形等，严重影响患者面部美观和咀嚼、发音等功能，降低了患者的生活质量。颌骨缺损的修复一直是困扰口腔临床医生及科研人员的难题。

近年来，生物医用材料与干细胞和各种生长因子结合的骨组织工程是近几年颌骨修复研究的热点。在人工骨生物材料植入颌骨后，免疫细胞特别是巨噬细胞在骨组织再生修复中发挥关键作用［1］。其形成的免疫微环境对成骨的影响等，已成为骨修复相关领域的焦点问题。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有成脂、成骨、成软骨的多向分化潜能，在骨组织愈合过程中起到重要的作用。巨噬细胞与BMSCs之间的相互作用影响骨组织再生修复。

本文我们总结了颌骨缺损修复重建过程中，不同极化表型的巨噬细胞对缺损区BMSCs 成骨分化的调控作用及其机制探索，为骨组织工程或原位骨组织再生的临床应用提供新的创新点。

1.巨噬细胞在颌骨再生中的作用

骨组织工程修复颌骨缺损，生物材料植入后必然经历免疫应答的几个阶段：致敏阶段、反应阶段、效应阶段［2］。在所有免疫细胞中，巨噬细胞作为关键的抗原识别和提呈细胞，参与了细胞免疫和体液免疫全过程。巨噬细胞可以通过改变其表型和生理活性来对外界环境的改变进行应答［3］。在组织损伤发生后，巨噬细胞首先表现经典活化型（M1型），M1型巨噬细胞能够引发炎症和机体的免疫应答反应，另外CXCL8，CCL2，CCL3 等相关趋化因子和TNF-α,IL-1β,IL-6 等相关促炎因子是由M1型巨噬细胞合成分泌的。然后，巨噬细胞逐渐转变为一种抗炎表型（M2型），由M2型巨噬细胞分泌的PDGF，FGF，IL-10，TGF-β 等相关因子，可以抑制炎症反应，促进局部组织修复的作用［4,5］。

骨组织的再生修复是一种多细胞多因子多步骤，发生时序性行为的结果。巨噬细胞可被招募至炎症部位，吞噬和消化细胞残片和病原菌，并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，对病原体作出反应。BMSCs 具有向成骨细胞分化的潜能，在骨组织愈合过程中发挥重要的作用。

膜内成骨和软骨内成骨是两种常见的成骨方式，其中来源于外胚层的颌骨，主要是以膜内成骨的方式发育成骨。而以软骨内成骨方式发育成骨的长骨来源于中胚层。与长骨相比，颌骨的BMSCs 具有部位特异性，具有自我更新能力、成骨能力以及血管生成能力，并随着年龄的增加其增殖和成骨分化的功能强于长骨［6］。巨噬细胞可通过调节BMSCs 的成骨分化在维持骨稳态和促进骨修复中发挥关键作用。

2.巨噬细胞极化状态对BMSCs成骨的影响

巨噬细胞在骨稳态中起到重要的作用，M1 和M2型巨噬细胞分别作用于骨修复的不同时期。M1型巨噬细胞作用于骨修复的早期，影响骨的形成。M2型巨噬细胞作用于骨修复的中后期，能够促进新骨的形成。初期M1型巨噬细胞的炎性程度和炎性时间长短、中期M1型巨噬细胞转换为M2型巨噬细胞的时间，以及后期M2 巨噬细胞的调控都是影响骨再生的关键因素［7］。

2.1 巨噬细胞对于维持骨稳态和促进骨修复至关重要 骨组织的修复始于炎症，炎症类型的转换决定骨组织修复的结果。巨噬细胞在骨组织再生修复中发挥关键作用，巨噬细胞-BMSCs相互作用有利于骨组织再生修复。Vi L 等［8］发现敲除巨噬细胞的转基因小鼠在发育过程中会发生早期骨骼生长迟缓和进行性骨质疏松，此外，巨噬细胞的敲除导致BMSCs 数量减少60%，并使这些细胞的成骨能力下降。He XT 等［9］研究发现小鼠M1 巨噬细胞上清能够增强小鼠BMSCs 的增殖和成脂分化能力，且巨噬细胞能促进BMSCs 的成骨分化，M2型巨噬细胞上清在一定程度上也促进了BMSCs的成骨分化潜能。

2.2 骨愈合早期，短暂的炎症微环境中，巨噬细胞促进成骨活动 骨生物材料植入体内，最初的炎症反应和促炎性M1 巨噬细胞活化有助于将BMSCs、骨祖细胞和血管祖细胞募集到缺损部位。同时M1 巨噬细胞会分泌相关的促炎性细胞因子，以往的研究认为M1巨噬细胞可诱导破骨细胞生成并增强其活性，从而导致骨质吸收。但是，最近的一些研究证实M1 巨噬细胞能起到促进成骨的作用。

斯坦福大学的Stuart B.Goodman教授课题组的系列研究中［10,11］，将小鼠BMSCs与M1、M2型巨噬细胞体外共培养，研究表明骨形成过程取决于最初的M1介导的促炎期，然后是M2介导的抗炎期。72至96小时的促炎环境对于最佳基质矿化至关重要。另外，Sadowska JM［12］将巨噬细胞系RAW264.7与羟基磷灰石、β-磷酸三钙两种材料共培养，然后将上清用于人BMSCs的成骨诱导，研究表明羟基磷灰石能够引起共孵育的巨噬细胞释放促炎性细胞因子，且更有效地上调BMSCs 中Ⅰ型胶原生成和成骨基因（Runx2）表达。这表明生物材料在体内的局部炎性微环境也影响了生物材料的成骨分化。Lei H等［13］用脂多糖诱导巨噬细胞M1极化，并与BMSCs共培养。发现巨噬细胞显著增强了BMSCs的迁移和成骨能力，并且甲基转移酶样3（METTL3）表达上调。当METTL3的表达被敲低时，情况正好相反。因此，M1巨噬细胞通过分泌METTL3诱导BMSCs成骨分化和迁移。

以上结果表明，初期炎症阶段对于增强骨形成至关重要，在骨修复早期存在的炎症性M1巨噬细胞有助于骨形成。但是牙周炎或者骨髓炎等炎性状态下会引起M1巨噬细胞持续产生大量促炎性细胞因子，破骨细胞活性增强和成骨细胞活性被抑制而导致骨吸收。Zhou LN等［14］在人牙周炎的牙龈样本中可观察到M1巨噬细胞数量更多（M1/M2比例更高），并且TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-12水平明显比正常牙龈升高。而牙周炎组织中更高程度的M1巨噬细胞浸润影响牙周炎的恢复并且导致牙槽骨的吸收。因此，M1介导的炎症的持续时间很关键，短暂的急性炎症是有益的，而慢性炎症对骨骼的愈合非常不利。

2.3 骨愈合中后期，M2巨噬细胞促进BMSCs成骨分化M2巨噬细胞主要是在成骨中后期发挥作用。M1巨噬细胞的存在会导致纤维囊的形成。如果M1巨噬细胞可以有效地向M2巨噬细胞转化，则能促进骨生成型细胞因子释放更多，形成新生骨组织［15］。

Zhang Y等［16］发现，M2巨噬细胞与MSCs共培养后，能增强MSCs的矿化作用。Loi F等［17］分别将M0、M1和M2原代小鼠巨噬细胞和小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1细胞共培养，以研究未激活的M0，促炎性M1和组织再生M2巨噬细胞对MC3T3-E1细胞体外成骨能力的影响。结果表明，M0,M1和M2巨噬细胞均可促进MC3T3-E1细胞的成骨能力。接种后72小时，IL-4诱导的M2巨噬细胞，可以进一步增强对MC3T3-E1的成骨作用。Zhang JK等［18］合成负载IL-4的富钙水凝胶，并在体内外评估了水凝胶对巨噬细胞极化的影响及巨噬细胞的极化状态对BMSCs成骨分化的影响。研究表明，水凝胶不但能够促进M2巨噬细胞极化，而且还可以高表达TGF-β 1，然后激活TGF-β1/Smad信号通路，进而促骨再生。

以上研究表明，在骨愈合后期，M2巨噬细胞可通过与BMSCs相互作用促进骨形成。这样提示，巨噬细胞可塑性会提供新的策略来调节生物材料植入体内后的局部炎症微环境，从而潜在地增强骨骼修复。

3.巨噬细胞与BMSCs细胞之间的调控机制

巨噬细胞与BMSCs两种细胞，相互作用的途径包括：细胞间直接接触、供体细胞分泌蛋白或分泌囊泡运输到受体细胞，调控受体细胞的生物学功能。调控的方式多种多样，可以通过信号通路调控下游基因，也可以通过影响转录因子、蛋白激酶等，或者配体受体结合、非编码基因的调控等多种方式［19］。

3.1 细胞间直接接触或分泌细胞因子 巨噬细胞与BMSCs细胞间的通讯方式可以通过直接共培养，利用细胞直接接触来进行调控［20］。巨噬细胞也可以通过其分泌的相关细胞因子调控BMSCs的成骨分化，这也是目前主要的研究方向［10-13］。巨噬细胞产生的大量细胞因子，包括骨形态发生蛋白2（BMP-2）、OSM等，它们可通过调节BMSCs中主要的成骨分化信号通路影响骨形成。

Romero-López M等［20］在体外模型中，将巨噬细胞与BMSCs共培养，将其诱导成骨分化，观察巨噬细胞对新骨形成的影响。结果显示，与单独的BMSCs相比，不同类型的巨噬细胞均增加了成骨分化，促炎性M1巨噬细胞最有效地增强了新骨的形成。这项研究说明了细胞间的互相接触在骨组织形成中的重要作用。Lu LY等［10］将极化后的小鼠原代巨噬细胞与BMSCs，按照播种密度5∶1进行直接共培养并诱导成骨。所有巨噬细胞-BMSCs共培养物中的骨矿化都增加了，并且促炎性M1巨噬细胞-BMSCs共培养物中最为显著。M1巨噬细胞调节的初始促炎期与成骨早期的前列腺素E2（PGE2）分泌密切相关，通过COX-2-PGE2途径促进骨髓间充质干细胞中的成骨作用。

3.2 供体细胞分泌囊泡运输到受体细胞 除了细胞间的接触和分泌细胞因子外，巨噬细胞还可以通过旁分泌囊泡调节成骨。旁分泌的囊泡中，外泌体起到了非常重要的作用。外泌体的粒径大小在30-150 nm之间，是细胞间通讯的重要载体［21］。巨噬细胞外泌体可以携带微小RNA（miRNAs）、蛋白、脂质等小分子在巨噬细胞与BMSCs之间进行信息交换，进而调节骨重塑相关信号通路［22］。不同极化状态巨噬细胞的外泌体，可以对成骨分化发挥不同的调控作用。

在炎症初期，M1型巨噬细胞的外泌体调控成骨分化。Xia Y［23］等用不同的细胞因子诱导RAW264.7细胞向M1或M2极化，并从非极化（M0）和极化（M1和M2）巨噬细胞中分离出外泌体。然后用正常培养基和补充有M0、M1、M2外泌体的成骨诱导培养基培养小鼠BMSCs，测定并分析了BMSCs的成骨分化能力。结果发现，来源于M1巨噬细胞的外泌体促进了细胞的成骨分化。另有研究表明［24］，LPS刺激的人外周血单核细胞释放外泌体培养MSCs 72小时后，成骨相关基因Runx2和BMP-2的表达。

中后期，M2 巨噬细胞外泌体调控成骨分化。Kang MY等［25］研究了M0、M1和M2极化巨噬细胞衍生的外泌体在骨修复中的作用。用M0、M1或M2来源的外泌体分别处理大鼠颅骨缺损，在3周和6周时发现M0 和M2分泌的外泌体促进骨修复。Xiong Y等［26］发现miR-5106在M2巨噬细胞衍生的外泌体中明显过表达，并且靶向SIK2 和SIK3 基因来诱导BMSCs 成骨分化。此外，向骨折部位局部注射miR-5106 激动剂或M2 巨噬细胞外泌体加速骨折愈合。

巨噬细胞外泌体可以被受体细胞BMSCs摄取，通过其携带的miRNAs等物质，在细胞间通讯中发挥重要的作用［26］。但是，巨噬细胞外泌体被BMSCs摄取并调控成骨的具体机制还需要进一步研究。

4.免疫调节在颌骨再生中的应用

通过免疫调节促进骨骼愈合的方法，可以利用预处理MSCs 以增强其免疫调节特性。预处理的MSCs首先与促炎细胞因子一起培养或暴露在缺氧条件下几天以模拟炎症微环境，然后再将其用于体外和体内研究。这与骨生物材料在植入初期时，短暂的炎症阶段增强骨形成的观点是一致的。Lu ZF等［27］研究表明，人脂肪MSCs分泌的外泌体能促进成骨细胞的增殖和分化。用肿瘤坏死子-α（TNF-α）处理脂肪组织MSCs，3天后，观察到MSCs分泌的外泌体能增强人成骨细胞的增殖和分化，这模拟了骨骼愈合的急性炎症初期。

其次，可以通过骨生物材料修饰，调节巨噬细胞M2极化来增强骨再生。Chen ZT等［28］强调了免疫应答在生物材料介导成骨过程中的重要性，并讨论了骨生物材料关于骨免疫调节性能的评价策略。目前关于生物材料引起的免疫反应对成骨的影响，主要集中在通过调节巨噬细胞M2极化来增强骨骼再生的可能性［29,30］。Qiao W等［31］在大鼠股骨缺损模型中使用释放Mg2+的藻酸盐水凝胶修复骨缺损，证明生物材料周围单核细胞-巨噬细胞-破骨细胞谱系的连续激活，促进骨再生的生物学过程。对于骨生物材料在骨形成过程中的免疫调节，适宜的免疫反应可以营造促骨形成的微环境，而不利的免疫反应则可能诱发慢性炎症，影响骨组织的愈合。

另外，还可以利用生物材料负载细胞因子或外泌体等，进行组织工程骨修复骨缺损。部分细胞因子对成骨的调控作用取决于所用剂量和时间，适当的细胞因子的浓度和时间有利于诱导成骨，不当的剂量和时间会导致骨吸收。Zhao DW等［32］使用不同浓度的IL4为3D打印钛种植体周围的BMSCs成骨和巨噬细胞极化创造仿生环境。结果表明，3D打印钛植入物结合30 ng/ml IL4从第3天到第7天调节巨噬细胞M2极化以促进骨再生。这将为我们把巨噬细胞分泌的细胞因子和外泌体进行骨组织工程的临床转化，提供坚实的理论基础。

5.研究展望

骨生物材料植入的初期炎症阶段，M1 巨噬细胞清除部分碎屑并启动骨修复。随着巨噬细胞由M1型转化为M2型，新生骨组织逐渐形成。但是，巨噬细胞分泌的细胞因子或外泌体的最佳作用剂量和时间，适当的浓度和递送方法对成骨的影响仍然需要精准化。因此，应在今后研究中进一步评估使用骨生物材料修饰、细胞因子和外泌体的序贯缓释、预处理BMSCs，或这些策略的组合，用以调控骨愈合过程。