糖尿病肾病中微小RNA在肾脏内皮-间充质转化中的调控机制

袁芸 李宇宸 杨璐瑶 胡琼英

(成都中医药大学 1附属医院检验科，四川 成都 611137；2医学技术学院)

内皮细胞是一种呈多边形厚度极薄的扁平状细胞，由其嵌合排列组成毛细血管、小动脉、动脉、静脉和淋巴管等血管结构的内表面，参与调节和维持血管通透性及物质交换的过程〔1〕。特殊情况下，完全分化的内皮细胞具有转化为其他类型细胞的可塑性，内皮细胞被生长因子刺激后发生形态功能变化，获得间充质样标志物，这一过程称为内皮-间充质转化(EndMT)〔2〕。机体在纤维化过程中，由成纤维细胞组成的纤维化组织不受控制地过度积累，同时分泌大量细胞外基质(ECM)，导致器官发生进行性功能障碍〔3〕。研究表明，肾纤维化主要成分成纤维细胞的来源除驻留在原地维持正常器官组织的成纤维细胞(50%)外，还包括来自骨髓的前体纤维细胞(35%)及从内皮细胞(10%)和上皮细胞(5%)转化而来的间充质细胞〔4〕，这一结果证实肾纤维化与EndMT的内在联系。Chen等〔5〕对小鼠进行5/6肾切除术诱导慢性肾病，在小鼠的肾皮质交界处观察到大量平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD)31阳性细胞，经抗纤维化处理后再未观察到这种阳性内皮源性细胞，提示阻断内皮EndMT过程有效阻止肾纤维化进程。

微小RNA(miRNA)是一种长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，通过靶向沉默基因mRNA的3′-非翻译区(UTR)在表观遗传水平上调节编码各种蛋白质的基因的表达，miRNA的表达直接影响着人体正常生命活动和各种疾病的发生发展〔6〕。糖尿病肾病(DKD)是糖尿病中的严重微血管并发症，也是各个国家终末期肾脏疾病(ESRD)的主要病因，而长期高糖环境下引发的肾脏纤维化是DKD典型的病理表现〔7〕，在DKD中的肾纤维化部分由具有内皮源性的成纤维细胞导致，提示EndMT参与DKD肾间质纤维化早期发展〔8〕。近年来，越来越多的研究发现DKD患者体内某些miRNA的特异性表达缺失或低表达可以使促进EndMT肾纤维化的靶向基因不受控制地翻译为相关功能蛋白，进一步加重病情〔9〕。尽管已经确定DKD的发病机制，但针对肾纤维化方面的研究和相关治疗仍不太乐观。因此确定影响肾纤维化EndMT途径相关因子表达的miRNA及具体的作用靶点可为DKD提供更精准的诊断方法与更优越的潜在治疗手段。本文就涉及DKD下调的常见miRNA在EndMT诱导肾纤维化过程中调控的机制研究作一综述，以期加深对DKD肾纤维化发病机制的了解，为DKD诊断和靶向治疗提供新的生物标志物。

1 miR-29

在一项关于DKD中miRNA的生物信息学分析中，Yang等〔10〕从基因表达综合数据库(GEO)获得与DKD相关的基因表达谱数据，经GEO2R筛选DKD患者和正常个体之间的差异表达基因(DEG)，确定表达下调的miR-29，同时分析指出，尿液中的miR-29水平反映患者蛋白尿和颈动脉内膜中层厚度的严重程度〔11〕。有实验证实，对小鼠进行单侧输尿管梗阻后，过表达miR-29能有效阻止肾脏的进行性纤维化〔12〕。二肽基肽酶(DPP)-4在内皮细胞稳态维持中发挥关键作用，DPP-4通过与整合素(integrin)β1相互作用可诱导血管表皮生长因子受体(VEGFR)1表达，促进EndMT进程，抑制DPP-4或intagrin β1会阻碍转化生长因子(TGF)-β2刺激的TGF-β受体TGF-βRs二聚体形成，消除TGF-β介导的信号传导〔13〕。Shi等〔14〕在对DKD治疗药物作用机制研究中发现，DPP-4抑制剂利格列汀通过调节内皮细胞中的miR-29水平靶向DPP-4的3′-UTR结合片段抑制其表达，参与TGF-β2诱导的EndMT，有效治疗DKD肾纤维化。而Sun等〔15〕通过实验发现，新型家族蛋白(Smad)3依赖性的纤维化长链非编码RNA-Erbb4-IR可结合miR-29的3′-UTR区抑制其转录，促进糖尿病中的肾纤维化和肾功能障碍。结合上述实验结果可知，miR-29参与的TGF-β/Smad3/miR-29/DPP-4调控通路可能为控制DKD中EndMT的有效靶点。目前DKD的有效治疗主要以降血压、降血糖两方面为主，实验人员发现用高血压药物卡托普利和利尿剂螺内酯联合干预治疗DKD小鼠，处理组小鼠miR-29a/b/c表达水平增加，并伴随TGF-β和蛋白尿的下降〔16〕，提示miR-29与病情的改善有直接关系。一项关于糖尿病视网膜病变的实验证明，在高糖培养可诱导人视网膜微血管内皮细胞内miR-29a/b表达下降，miR-29a/b通过下调神经源性基因座缺口同源蛋白(Notch)2抑制糖尿病视网膜纤维化病变中的EndMT〔17〕，这一结果说明由miR-29调控的Notch2信号传导可能参与同为糖尿病微血管病变的DKD肾纤维化EndMT过程。

2 miR-let-7

在参与调节免疫细胞能量和代谢的同时，miR-let-7还调节胰岛素的信号传导和葡萄糖稳态，从而影响糖尿病的病情发展〔18〕。Wang等〔19〕对DKD患者的血浆进行miRNA差异性分析，与健康对照组相比，DKD组中miR-let-7家族的表达降低，其诊断性能验证受试者工作特征曲线下面积(AUC)>0.7提示miR-let-7在DKD中潜在的诊断价值。研究表明，FGF通过调节miR-let-7控制TGF-β相关配体和受体表达，减弱内皮细胞对TGF-β的响应，进而抵抗TGF-β介导的EndMT〔20〕。Wang等〔21〕研究发现，在DKD过程中被抑制下调的miR-let-7b直接靶向结合TGF-β受体TGFβR1的mRNA3′-UTR区降低下游蛋白Smad3活性从而抑制TGF-β途径的肾纤维化。血管紧张素转化酶底物AcSDKP作为一种内源性抗纤维化肽，可将DKD小鼠中表达被抑制的FGFR1和miR-let-7恢复至正常水平，提示其EndMT抑制作用〔22〕。实验证实，内皮细胞线粒体合成障碍或功能异常引起EndMT，抑制FGFR1表达消除AcSDKP对线粒体动力学的正向促进作用；上调miR-let-7b-5p恢复由AcSDKP介导的线粒体分裂融合的相对平衡〔23〕。由此可知，miR-let-7在维持内皮细胞稳态中存在双重积极作用，一方面，调节EndMT激活因子TGF-β活性；另一方面，参与调控内皮细胞线粒体动力学，维持线粒体的功能和质量，保证内皮细胞的正常活动。另外，miR-let-7和miR-29在发挥抗纤维化作用时存在串扰作用，AcSDKP发挥抗肾脏纤维化作用时，内皮细胞中的miR-29上调，抑制干扰素-γ，进而激活FGFR1磷酸化，阻止TGF-β和其相关信号传导，最终导致miR-let-7增加〔24〕，这一结果表明miR-let-7和miR-29之间的这种相互作用对于AcSDKP/FGFR1调节轴维持内皮细胞的稳态及抗纤维化至关重要。

3 miR-126

Wang等〔25〕在对DKD患者尿白蛋白排泄率等临床指标及相应miRNA进行系统评价后，发现DKD患者体内特异性下调的miR-126。具有重度蛋白尿症状的DKD患者的miR-126表达水平比微量蛋白尿患者更低，与对照组相比，患者miR-126水平与空腹血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油和低密度脂蛋白含量呈负相关〔26〕。控制患者血糖、血脂、血压及蛋白尿一直是DKD治疗及预后的重要措施，这些结果提示miR-126水平与DKD的病情发展密切相关，与DKD常规检测指标联合使用可成为一项有力的DKD风险评估生物标志物。使用特定RNA拮抗剂阻断内皮祖细胞微泡中具有促血管生成作用的miR-126，微泡对缺血再灌注肾损伤的肾脏保护作用被消除，促进肾纤维化〔27〕。Zhang等〔28〕用TGF-β1诱导内皮祖细胞EndMT，观测到miR-126表达下降，过表达miR-126逆转EndMT发生；经靶点研究确认miR-126可结合PIK3R2的PI3K/AktB信号通路参与的EndMT，上调CD31等内皮细胞标志物，下调α-SMA等间充质标志物表达。E26转录因子(ETS)转录因子ETS-1被证实通过调节基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-2组织抑制剂(TIMP)-2的系统平衡影响ECM沉积，影响DKD肾纤维化进程〔29〕。研究表明，在内皮细胞中敲减ETS转录因子组合ETS相关基因(ERG)和Friend白血病整合素(FLI)1转录因子诱导细胞发生EndMT及细胞动态表观遗传变化，miR-126作为两种转录因子的关键下游靶标部分阻断EndMT的诱导〔30〕。然而，也有研究得出不同的实验结论，Beltrami等〔31〕发现，与对照组相比，DKD患者组尿液中的miR-126含量显著增加，经组织miRNA定位和释放后发现，与足细胞、肾小管上皮细胞及成纤维细胞相比，miR-126在肾小球内皮细胞中呈富集状态。这一结果与之前的研究不一致，但miR-126与多种检测指标的密切联系及在EndMT中的直接调控作用仍表明miR-126对于DKD而言是一种极具诊断潜力的生物标志物。与此同时，miR-126在其他细胞系中也发挥改善DKD的作用，如Cao等〔32〕发现茶多酚可通过miR-126调控Akt-p53-p21信号通路来缓解高糖诱导的肾小球系膜细胞衰老。

4 miR-424

先后有研究表明，不管是在DKD患者的尿液中还是在DKD动物模型的肾组织内，DKD组的miR-424含量都处于低水平，上调miR-424调节改善DKD大鼠肾功能，修复糖尿病性肾脏病变〔33,34〕。Chamorro-Jorganes等〔35〕通过生物信息学方法鉴定出VEGF，VEGFR2和FGFR1可作为调节血管生成的重要调节基因，同时利用可结合序列分析和荧光素酶报告预测影响上述物质表达的靶标miRNA，确定miR-424靶向VEGF，VEGFR2和FGFR1的3′UTR区抑制三种因子的表达及相关信号传导，从而减少内皮细胞的增殖、迁移及血管自主生成。上述关于miR-29及miR-let-7的阐述中提及VEGF及FGF均表现出对TGF-β刺激的EndMT的阻碍作用，由此可推断出，miR-424通过靶向调节这些因子及相关受体的活性参与DKDEndMT。另外，研究指出由高糖诱导的EndMT实际上依赖于MAPK/ERK1/2的激活〔36〕，Yang等〔37〕指出在内皮细胞中上调miR-424靶向FGFR1抑制bFGF/FGFR1途径，调节ERK1/2磷酸化水平，这一结论同样支持上述miR-424抗EndMT的观点。合理的饮食在DKD治疗中极其关键，主要以低蛋白、低糖、低脂为主。一项饮食改善疾病研究显示，长时间摄入猕猴桃果汁可提升糖尿病患者血清中的miR-424、抗氧化因子核因子E2相关因子(Nrf)2和Kelch样ECH关联蛋白(Keap)1，降低炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6，改善患者血脂和炎症情况;Spearman等级相关度分析显示，患者血清miR-424水平与IL-1β、IL-6呈负相关，与抗氧化物超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等呈正相关〔38〕。综上所述，miR-424既可阻止由EndMT介导的肾纤维化，又可阻止机体长期高血糖环境下的炎症和氧化应激，在糖尿病进程中发挥保护性作用。

5 其他miRNA

除上述miRNA外，还有一些其他DKD中呈下调趋势的miRNA被证实参与EndMT进程发挥其抗纤维化作用，如miR-25〔39,40〕、miR-497〔41〕、miR-346〔42〕、miR-448-3p〔43〕，部分miRNA基于其表达水平与患者体内蛋白尿含量呈负相关，可作为检测病情的有效指标。Liu等〔40〕在DKD小鼠体内注射miR-25激动剂后可缓解小鼠的蛋白尿水平、肾纤维化程度及继发性血压症状，随后的靶基因研究结果显示miR-25靶向原癌基因Ras下游效应物CDC42活性，抑制Ras的激活，减弱MEK/ERK信号级联通路对TGF-β的放大效应〔44〕，从而缓解肾脏EndMT的发生。最新发现褪黑素可通过激活miR-497含量靶向抑制ROCK1和ROCK2，缓解糖尿病大鼠肾小球组织中的EndMT和暴露于TGF-β2的肾小球内皮细胞中的EndMT，达到治疗DKD的目的〔41〕。miR-346在EndMT经典激活通路TGF-β/Smad下游蛋白Smad3/4的3′-UTR中存在多个互补结合位点，用带有miR-346的质粒处理糖尿病小鼠显著改善DKD引起的肾功能障碍〔42〕。miR-448-3p被证实通过靶向DPP-4抑制TGF-β/Smad信号通路介导的EndMT进程，改善糖尿病血管内皮细胞功能障碍〔43〕，阻止肾纤维化。

综上，对血糖、血压及肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻断剂的合理控制已成为治疗DKD的常规策略，但基于这些研究的新药未能在人类随机临床试验中证明其有效性和安全性。通过靶向肾小球滤过膜、炎症途径激活和肾纤维化等具体发病机制的治疗能够从根本上延缓DKD的病情，所以进一步了解DKD致病的分子机制有助于新型靶向药物的开发〔45〕。内皮细胞作为肾脏的主要构成细胞系之一，易被高血糖、晚期糖基化终末产物、氧化应激产物或生长因子刺激发生功能障碍、表型改变，转化为成纤维细胞参与肾纤维化，阻断这一过程将是肾纤维化治疗的有力措施。见图1。

关于miRNA的研究仍然存在一些局限性，将其列入临床上DKD肾纤维化常规的诊断和治疗方法面临理论和实践上的挑战。主要问题有：miRNA的内在联系还有待探究。由于广泛调控的特性，miRNA不止参与EndMT进程还会参与其他信号通路产生交互调控的现象，若在人体中应用是否会影响到相关miRNA最终的抗纤维化效果？EndMT的多致病性。除了诱导纤维化疾病的发生发展，EndMT被证实促进恶性肿瘤，心血管疾病，并且与感染性炎症密切相关〔3〕。通过控制DKD中表达下调的miRNA介导EndMT相关的肾纤维化过程，是否还会激活机体其他病理过程？而激活的病理过程又是否会进一步恶化肾纤维化病情？关于miRNA的研究已成为生命科学与人类医学的热点，相信经过人们的不断探索后，这些问题终将迎刃而解。