亚致死剂量呋虫胺对意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相关基因表达和酶活性的影响

张宇昊，马卫华，刘晋佳，马秀梅，姜玉锁，*

(1.山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801)

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)具有产量高、易管理、繁殖能力强等特点，已成为我国主要饲养的蜜蜂品种。它不仅能够通过蜂产品创造价值，还能通过授粉提高作物产量并改善作物品质为人类带来更大的经济价值，因此，意大利蜜蜂对促进农业的可持续发展具有重要的作用。近年来，随着农业现代化、规模化的飞速发展，各式各样的杀虫剂被广泛地使用导致授粉昆虫生存条件恶劣，数量正在急剧下降。从2006年冬季开始，美国出现蜂群崩溃失调现象造成蜂农饲养的蜜蜂大面积消失，野生蜜蜂丰度和多样性下降[1]。有研究指出，引发该现象的主要原因之一是蜜蜂长期暴露在残留的化学毒素环境中[2]。因此，如何保护蜜蜂从而维持长期稳定的生态环境已成为全球亟待解决的生物安全问题。

新烟碱类杀虫剂是当前普遍采用的杀虫剂类别，具备出色的内吸活性、高效率、高持续性，是有效防治刺吸式口器害虫(木虱、蚜虫、粉虱、叶蝉、椿象)的首选药剂。新烟碱类杀虫剂的作用机制主要是通过选择性结合昆虫神经系统的乙酰胆碱受体(AchR)结合位点，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，导致昆虫过度兴奋，最终麻痹而死，此外，新烟碱杀虫剂被植物吸收后残留于花蜜和花粉之中除了能有效杀灭靶标昆虫外，还会对许多传粉媒介产生负面影响[3-4]。蜜蜂日常的采集行为，会大量接触到残留农药的花粉花蜜。近年来，有研究发现，新烟碱杀虫剂会造成蜜蜂脑部受损[5]并且影响蜜蜂采食效率[6-7]、记忆和飞行能力[8]，新烟碱杀虫剂会降低蜜蜂的繁殖力和生长速度[9]。此外，亚致死剂量的新烟碱类杀虫剂已被证明会损害蜜蜂的学习能力并导致其免疫系统受损[10]。

呋虫胺作为用于防治害虫的新一代新烟碱类杀虫剂，具备速效、无抗药性、渗透性强、杀虫谱广等特性。近年来，关于呋虫胺胁迫对意大利蜜蜂影响的相关研究表明，呋虫胺在实验室条件下对成年工蜂的毒性等级为高毒[11]。新出房的工蜂经LC10剂量的呋虫胺处理后，脑部差异表达的miRNA主要与蜜蜂的发育、神经传导和免疫防御有关[12]。然而目前关于亚致死剂量呋虫胺胁迫对意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活性的影响鲜有报道。

本试验旨在探究亚致死剂量呋虫胺胁迫下，意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相关基因表达情况及免疫解毒酶系活力。对Abaecin、Apidaecins、Defensin-1、Hymenoptaecin、AChE-2、PPO、GST和Cyp450基因的表达量情况，饲喂后蜜蜂体内多酚氧化酶、乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶和过氧化氢酶活性变化。试验结果可为进一步明确亚致死剂量呋虫胺对蜜蜂健康的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

原药呋虫胺购自美国MedChemExpress公司，丙酮(天津市致远化学试剂有限公司)，TRIZOL(Thermo公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒(TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) 试剂盒(TaKaRa公司)，总蛋白定量测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶(AchE)测定试剂盒、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)测定试剂盒、多酚氧化酶(PPO)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒和总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；人工气候箱、EU-2600A紫外分光光度计(上海昂拉仪器有限公司)，荧光定量PCR仪(BIORAD公司)。

1.2 供试蜜蜂

试验所用的意大利蜜蜂取自山西农业大学实验蜂场，上午9：00在3个健康群体的蜂箱入口处抓取携带花粉的采集蜂，将收集到的蜜蜂转移至塑料饲喂盒(8 cm×8 cm×6.5 cm，长×宽×高)中，每盒30只，共21盒(对照组和6个处理组，每组3个重复)，随后将饲喂盒放入恒温恒湿培养箱中培养48 h(温度28 ℃，相对湿度70%，黑暗)，用于呋虫胺急性经口毒性试验；另抓取携带花粉的采集蜂，每盒30只，共9盒(对照组和2个处理组各3盒)用于亚致死剂量呋虫胺处理。

1.3 呋虫胺的处理

取10 mg呋虫胺原药溶于100 mL丙酮中制成100 mg·L-1的呋虫胺储液。将适量的储液通过50%蔗糖溶液稀释至不同浓度梯度。将收集的蜜蜂饥饿处理2 h后，向塑料饲喂盒中加入不同浓度梯度的蜜药混合液(每只蜜蜂15 μL)，待消耗完毕后加入50%的蔗糖溶液，让其自由取食，每8 h更换蔗糖溶液，并移除死蜂，连续记录48 h，求出毒力曲线。

根据急性毒性试验的结果，采用LC20和LC50的呋虫胺处理蜜蜂，处理48 h后，直接放入液氮速冻，转至-80 ℃冰箱中冻存。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

每组取3只意蜂于液氮中研磨，按照比例(1∶1 000)加一定量TRIZOL提取总RNA，使用NanoDrop 2000检测RNA质量及浓度，将所有样品RNA浓度调至500 ng·mL-1，依照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

使用荧光定量试剂盒进行qRT-PCR分析，反应条件为：95 ℃预变性20 s；95 ℃变性20 s，60 ℃退火及延伸20 s，45个循环。以β-actin为内参基因，结果根据2-ΔΔCT法计算并分析，引物序列见表1。

表1 本实验所用引物对序列信息

1.6 免疫解毒酶系活力的测定

1.6.1 酶液的制备

分别取对照组和2个处理组各3只蜜蜂，用冰冷的生理盐水进行冲洗，随后放入液氮研磨，称量0.2 g组织放入有1.8 mL的匀浆介质的烧杯内，在冰浴条件下用手持匀浆仪匀浆5 min。最后在高速冷冻离心机(4 ℃，12 000×g)中离心15 min，收集上清液作为酶提取液，放入-80 ℃保存。

1.6.2 蛋白含量测定

采用BCA法[13]对酶液进行总蛋白含量的测定。

1.6.3 酶活性测定

按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明测定各组意蜂体内PPO、AChE、SOD、GST和CAT的活性。

1.7 数据分析

所有数据均使用SPSS统计分析软件(版本26.0)进行分析，方法用完全随机区组设计的单因素方差分析法(one-way ANOVA)，多重比较用LSD法，进行显著性检验(P<0.05为差异显著)，结果用均值±标准误(SEM)表示。使用GraphPadPrism 7软件包进行图形制作。

2 结果与分析

2.1 毒力测定

试验设置了3、1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75 mg·L-1共6个处理组，每组3个重复，每个重复30只蜜蜂。经计算得出呋虫胺胁迫意大利蜂采集蜂的LC20和LC50分别为0.458和0.988 mg·L-1，结果见图1。

y为呋虫胺浓度的常用对数值；x为死亡概率。

2.2 呋虫胺对意大利蜜蜂采集蜂体内免疫解毒相关基因表达的影响

采用qRT-PCR技术检测了意蜂取食0.458mg·L-1和0.988 mg·L-1呋虫胺蔗糖溶液48 h后，4种免疫相关抗菌肽基因Abaecin、Apidaecins、Defensin-1和Hymenoptaecin以及4种解毒基因AChE-2、PPO、GST、Cyp450的表达量变化。

LC20组中PPO、Apidaecins、Defensin-1和Hymenoptaecin基因表达量与对照组相比有显著上调趋势；LC50组中AChE-2、PPO、GST、Cyp450、Apidaecins和Defensin-1表达量有显著上调趋势，Abaecin和Hymenoptaecin基因表达量有显著下调趋势。LC50组中的Abaecin和Hymenoptaecin表达量均显著低于LC20组，而AChE-2、PPO、GST、Cyp450和Apidaecins基因表达量显著高于LC20组(图2)。

CK，50%蔗糖水；LC20，0.458 mg·L-1呋虫胺蔗糖溶液；LC50，0.988 mg·L-1呋虫胺蔗糖溶液。下同。同一基因下，柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.3 呋虫胺对意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒酶系活性的影响

LC20组与对照组相比(图3)，AChE、CAT和SOD活性均有显著下调趋势；LC50组与对照组相比，AChE、PPO、CAT和SOD活性均有显著下调趋势。

柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。

3 讨论

蜜蜂作为传粉媒介在陆地生态系统和农业领域中发挥重要的功能作用，随着杀虫剂的广泛使用，传粉媒介极有可能接触到残留的杀虫剂导致健康受损[14]。亚致死剂量的杀虫剂会影响昆虫的生理、行为和种群密度[15-16]，会降低昆虫的繁殖力和存活率[17-18]。有研究发现，亚致死剂量噻虫嗪胁迫蜜蜂会导致免疫相关基因发生变化[19]，此外，亚致死剂量的吡虫啉破坏了蜜蜂的求偶行为导致交配率下降80%[20]。我们首先在实验条件下测定了呋虫胺胁迫蜜蜂的急性经口毒性大小，发现在48 h时LC20和LC50分别0.458和0.988 mg·L-1，并探究了两个亚致死浓度(0.458和0.988 mg·L-1)呋虫胺胁迫对意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相关基因表达变化及酶活性变化的影响。

蜜蜂的先天免疫反应由复杂的个体机制和特殊行为组成。包括细胞免疫和体液免疫，可针对环境中残留的杀虫剂作出即时反应，如基因的调控和体液因子的激活。Abaecin是一种抗菌肽，属于富含脯氨酸的肽家族，有更广谱的抗革兰氏阴性菌作用[21]。Defensin-1是属于富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽家族，在抵御入侵病原体的防御中起关键作用[22]。Hymenoptaecin是一种由 93 个氨基酸组成的线性肽，属于富含甘氨酸的肽家族，能够抑制革兰氏阴性菌生长[23]。Apidaecins是一种含有18个氨基酸残基的小肽，富含脯氨酸，主要对革兰氏阴性菌起作用[24]。本试验结果显示，LC50组Abaecin和Hymenoptaecin表达量均显著下调说明呋虫胺会负面影响意蜂的免疫功能，同时Apidaecins和Defensin-1表达量显著上调，我们认为当受到外来物质的挑战时，这两个基因的表达是有助于蜜蜂应对呋虫胺的胁迫，说明呋虫胺胁迫会刺激蜜蜂的免疫应答，改变免疫基因的表达量，有助于揭示呋虫胺对意大利蜜蜂免疫系统的影响。

AChE-2主要分布于蜜蜂的中枢神经内，参与体内神经递质的传递[25-26]。PPO通过转录翻译多酚氧化酶，在蜜蜂生长过程中发挥作用[27]。GST是多功能抗氧化酶超家族的成员，在解毒和防止由活性氧引起的氧化损伤方面发挥着关键作用。Cyp450是存在于昆虫体内的多功能解毒酶，参与对杀虫剂的解毒代谢作用[28]。结果显示，LC50组的AChE-2、PPO、GST和Cyp450的表达量均显著上调，说明呋虫胺对解毒基因有诱导效应，这与先前的研究结果相似，吡虫啉对Ace2具有诱导效应[29]。噻虫嗪将诱导意大利蜜蜂CYP6AS3和CYP6AS5基因的上调表达[30]。

AChE、PPO、GST、CAT和SOD均为蜜蜂体内重要的解毒代谢酶系。AChE可催化神经递质乙酰胆碱水解为胆碱和醋酸盐，是新烟碱类杀虫剂的主要作用靶标[31]。GST是一种昆虫体内的主要解毒酶，能够代谢内源性和外源性化合物[32]。SOD和CAT是清除昆虫体内多余的活性氧，可抵御这些活性氧化剂引起的氧化损伤，保护细胞免受氧化应激和损伤方面发挥重要作用。PPO是一种免疫蛋白，主要介导昆虫体液免疫系统[33]。本研究中试验组体内的GST与对照没有显著差异，表明意大利蜜蜂体内的GST没有受到呋虫胺的胁迫而激活。而亚致死剂量呋虫胺处理组中蜜蜂体内的其他4种酶活性与对照组相比均显著下调，进一步说明亚致死剂量呋虫胺胁迫下抑制意大利蜜蜂解毒酶系活性，导致蜜蜂对呋虫胺的代谢能力下降，最终可能会影响蜜蜂的行为能力。

4 结论

综上，本研究通过毒力测定、免疫解毒相关基因表达和解毒酶系活性3个层面探索亚致死剂量呋虫胺对意大利蜜蜂采集蜂的影响。结果表明，亚致死剂量呋虫胺胁迫影响意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相关基因的表达及解毒酶系活性，扰乱意大利蜜蜂正常的免疫系统进而对其健康和生存造成影响。研究结果可为深入研究亚致死剂量呋虫胺对意大利蜜蜂代谢和生理的影响进一步提供依据。