秸秆促腐菌剂对稻麦轮作土壤养分变化特征的影响

樊海丹,吕卫光,褚向乾,白娜玲,郑宪清,李双喜,张娟琴,张海韵,张 月,王全华,张翰林①

(1.上海市农业科学院生态环境保护研究所,上海 201403;2.上海师范大学生命科学学院,上海 201418;3.国家农业科学农业环境奉贤观测实验站,上海 201403;4.上海市设施园艺技术重点实验室,上海 201403)

秸秆还田作为应用最为广泛的生态农业技术之一，不仅可以替代部分化肥施用，还能有效增加土壤有机碳含量，减缓土壤水分流失，从而达到提高土壤肥力的效果[1]。然而，由于秸秆田间腐解时间长、土壤肥力增效慢等问题，秸秆还田技术应用仍有待优化。微生物对于促进秸秆腐解具有重要作用，周柳强等[2]在红壤区的研究发现水稻秸秆粉碎加菌剂处理能使腐解率提高6.30%～7.30%；N、P、K养分释放率分别提高1.00%～5.80%、11.6～14.9%和2.20%～5.30%。魏赛金等[3]认为，秸秆促腐菌剂能够显著提高土壤养分含量，增加土壤氮磷循环相关微生物种群，降低水稻致病菌数量，从而促进小麦生长和产量增加。在秸秆还田条件下，添加复合菌剂不仅能够提高土壤微生物活性，调节土壤碳氮比，更主要是能够加速秸秆腐解及养分释放。微生物菌剂(以腐解菌为主)与化肥配合施用能够缓解秸秆还田土壤高碳氮比的情况，加快秸秆腐解，然而，以往研究大多只聚焦于促腐菌剂的添加对土壤碳氮比的影响，而忽略了对磷含量的影响[4]。

磷是植物生长必需的营养元素之一，秸秆还田有助于增加土壤碳、氮、磷等养分含量，提高稻田土壤磷的有效性[5]。但目前秸秆还田与微生物菌剂配合施用对土壤磷循环的影响机制尚不明确。phoD基因是细菌中用于编码碱性磷酸酶的最主要的基因，在陆地生态系统磷循环中占主导地位[6-7]。长期施用磷肥可使土壤磷含量和物种多样性发生变化，改变phoD基因组成，进而对碱性磷酸酶活性产生影响。微生物产生的碱性磷酸酶主要是对不稳定的有机磷进行矿化，表明其群落特征与有机磷形态、含量及磷酸酶之间存在密切联系，可以用于表征土壤磷循环的活跃程度[8]。CHEN等[9]研究表明，phoD基因α多样性与速效磷之间存在显著相关性，而phoD基因群落结构变化则与pH和磷的有效性相关。因此，以稻麦轮作系统为研究对象，采用MiSeq平台高通量测序技术，阐述秸秆还田配施菌剂对土壤养分特征和phoD微生物群落的影响，为秸秆高效还田提供科学与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019年5月至2021年5月在上海市崇明区上实现代农业园区试验基地(31°45′81″ N，121°87′94″ E)进行。该地区属亚热带季风气候区，四季分明，气候温和湿润，日照充足，雨水充沛，年平均气温为15.2 ℃，年平均降水量为1 128.8 mm，年日照时长达2 104 h，无霜期约为229 d，适于农作物生长。

1.2 试验设计

试验地长期进行水稻-小麦轮作，在稻麦秸秆全量还田条件下，共设置2个处理：(1)常规施肥+秸秆还田(CK)；(2)常规施肥+秸秆还田+秸秆促腐菌剂(IT)。每个处理设置3个重复。每个重复小区面积为666.67 m2。各处理施肥纯氮量保持一致，其中，稻季为225 kg·hm-2，麦季为180 kg·hm-2。施用肥料为复合肥(15-15-15)和尿素。田间管理措施与当地高产田块相同。秸秆促腐菌剂(粉剂)由上海大井生物工程有限公司提供，主要含有枯草芽孢杆菌和哈茨木霉菌，有效活菌数≥2亿·g-1，菌剂标准纤维素酶活为30 U·g-1，菌剂中氮、磷质量分数均为6%，经核算后计入总施肥量。稻麦两季秸秆还田时均添加溶于水后的秸秆促腐菌剂，每次菌剂添加量为15 kg·hm-2。

1.3 样品采集与测定

1.3.1样品采集

土壤样品于2021年5月小麦收获期采集。利用取土器和环刀，采用梅花形取样法采集0～20 cm深度土样(约2 kg)混合，储存在低温保鲜袋中带回实验室。在实验室一部分土壤样品风干过2 mm孔径筛后进行理化性质测定，一部分样品保存在4 ℃条件下进行土壤酶活性测定，另一部分放于-80 ℃冰箱用于土壤总DNA提取及微生物指标分析。沿各处理小区对角线取5个1 m2样方，从每个样方中随机抽取12株小麦用于分析测定。

1.3.2土壤样品理化性质测定

土壤容重采用环刀法测定。土壤水稳性团聚体采用湿筛法进行测定[10]，取50 g风干土样搅拌溶解后倒入团聚体分析仪套筛最上部(套筛孔径自上而下粒径逐渐变小，依次为2.0、1.0、0.5、0.25和0.053 mm)，沿桶壁缓慢加入去离子水直至没过土样，浸泡5 min，然后以20次·min-1的频率振荡30 min，收集各级土筛内的土样于烧杯中，粒径<0.053 mm的团聚体则在筛桶内沉降48 h后，弃去上清液转移至烧杯中，烘干后称重，每个处理重复3次。pH采用电位法〔m(水)∶V(土)为2.5∶1〕测定，有机质含量采用高温外热重铬酸钾氧化-容量法测定，腐殖酸含量采用焦磷酸钠-氢氧化钠提取重铬酸钾氧化容量法测定，全氮(TN)含量采用凯氏定氮法测定，全磷(TP)含量采用酸溶-钼锑抗比色法测定，全钾(TK)含量采用氢氟酸-高氯酸消煮法测定，速效氮(AN)含量采用碱解扩散法测定，速效磷(AP)含量采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定，速效钾(AK)含量采用乙酸铵提取-火焰光度计法测定，土壤电导率(EC)采用m(水)∶V(土)为5∶1浸提法测定。秸秆腐解率采用尼龙网袋法测定，将风干秸秆剪成约10 cm长，装入尺寸为15 cm×10 cm的0.25 mm孔径尼龙袋，每个小区放置15个尼龙袋，并置于0～20 cm深度。每隔30 d取3个尼龙袋进行秸秆腐解率测定，结果取平均值。将尼龙袋中秸秆残余物冲洗干净后干燥、称重，用失重法计算秸秆腐解率[11]。

1.3.3土壤酶活性测定

纤维素酶采用土壤纤维素酶(S-CL)活性检测试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)测定，蔗糖酶采用土壤蔗糖酶(S-SC)测试盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定，碱性磷酸酶采用土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)测试盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定。

1.3.4土壤样品总DNA的提取及微生物分析

取0.5 g土样，采用MoBio PowerSoil®DNA提取试剂盒提取土壤DNA。将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。采用phoD-F733(5′-TGGGAYGATCAYGARGT-3′)和phoD-R1083(5′-CTGSGCSAKSACRTTCCA-3′)引物对phoD基因片段进行扩增[12]，25 μL PCR反应体系如下：正向和反向引物各0.8 μL，12.5 μL DNA聚合酶，1 μL DNA，无菌水9.9 μL。PCR扩增程序：95 ℃变性5 min，95 ℃下30 s，58 ℃下30 s，72 ℃下30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经过纯化后，送至上海派森诺生物科技有限公司，采用Novogene公司Illumina NovaSeq 6000测序仪(2×250 bp双端测序)进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，再对序列数据进行过滤[13]。

1.4 指标计算与统计分析

水稳性大团聚体数量(R0.25，%)计算公式[10]为

(1)

式(1)中，Mr>0.25为粒径>0.25 mm的团聚体质量，g；MT为团聚体总质量，g。

土壤团聚体平均质量直径(MWD，DMW，mm)计算公式[10]为

(2)

土壤团聚体几何平均直径(GMD，DGM，mm)计算公式[10]为

(3)

式(2)～(3)中，Xi为i粒级团聚体平均直径，mm；Wi为i粒级团聚体质量分数，%。

秸秆腐解率(Rd，%)计算公式[11]为

(4)

式(4)中，W1为初始秸秆干质量，g；W2为腐解后秸秆干质量，g。

所有数据均采用SPSS Statistics 25.0进行统计分析，采用单因素方差分析(ANOVA)进行显著性检验。采用Excel 2016进行数据计算和图表制作。

2 结果与分析

2.1 菌剂配施对秸秆腐解的影响

如图1所示，5个取样时间点IT处理小麦秸秆腐解率均显著高于CK处理，分别提高33.8%、39.4%、42.1%、21.3%和22.4%，在小麦秸秆粉碎覆盖还田条件下，添加秸秆促腐菌剂对秸秆快速腐解有显著促进作用。

CK为对照，IT为添加促腐菌剂处理。*表示P<0.05。

2.2 菌剂配施对土壤理化性质以及小麦产量和籽粒的影响

不同处理水稳性土壤团聚体分布见表1。如表1所示，2个处理<0.053 mm粒级水稳性土壤团聚体质量分数均最大，范围在61.2%～72.6%之间，但不同粒级质量分数无显著差异。IT处理>2.0、>1.0～2.0、>0.5～1.0、>0.25～0.5和0.053～0.25 mm粒级水稳性土壤团聚体质量分数较CK分别增加37.0%、34.3%、135%、40.6%和14.8%。以R0.25、MWD和GMD指标分析土壤团聚体稳定性，IT处理R0.25较CK提高62.5%，MWD显著增加46.7%，GMD则增加22.2%。

表1 不同处理水稳性土壤团聚体分布特征

小麦产量和籽粒氮磷钾养分含量(表2)表明，虽然IT和CK两个处理间小麦产量无显著差异，但IT处理产量比CK提高9.8%。与CK相比，IT处理籽粒全磷含量显著提高28.1%，而籽粒全氮和全钾含量无显著差异，但数值上IT处理均高于CK，全氮和全钾含量分别提高0.42%和0.65%。

表2 不同处理土壤理化性质和小麦产量与籽粒养分分析

由表2可知，两个处理土壤容重和pH无显著性差异，但IT处理均略低于CK。IT处理有机质、速效氮和速效磷含量分别比CK显著提高11.8%、59.8%和62.6%。两个处理腐殖酸、全氮、全磷、全钾和速效钾含量均无显著差异。IT处理EC则比CK显著降低8.70%。

2.3 菌剂配施对土壤酶活性的影响

相较于CK，添加促腐菌剂能够有效提高相关土壤酶活性。由图2可知，IT处理纤维素酶和碱性磷酸酶活性均显著优于CK，纤维素酶和碱性磷酸酶活泩分别显著提高26.4%和33.8%。两个处理间蔗糖酶活性无显著差异，但IT比CK在数值上高10.9%。

CK为对照，IT为添加促腐菌剂处理。*表示P<0.05。

2.4 菌剂配施对土壤phoD多样性和群落结构的影响

不同处理土壤phoD微生物群落α多样性指标见图3。

CK为对照，IT为添加促腐菌剂处理。*表示P<0.05。

Chao 1指数用于表征物种数量，IT处理比CK显著提高10.9%；Shannon、Simpson和Pielou e指数用于表征物种多样性，两个处理间虽无显著性差异，但IT处理较CK分别提高5.19%和1.05%和3.39%。

Venn图能够直观展现不同样本之间的物种重叠情况。由已得数据可知，IT和CK处理之间重叠物种数量有3 457种，IT处理特有物种为1 547种，CK特有物种有1 144种，IT处理独有phoD物种数量更多。

在门水平上挑选phoD微生物群落丰度排名前7位的物种绘制成图。如图4所示，IT和CK处理土壤优势phoD种群均为放线菌门(Actinobacteria，33.1%～40.1%)，其他主要种群还包括浮霉菌门(Planctomycetes，4.52%～5.49%)、变形菌门(Proteobacteria，3.74%～4.07%)、厚壁菌门(Firmicutes，0.51%～0.63%)、酸杆菌门(Acidobacteria，0.07%)和蓝细菌门(Cyanobacteria，0.02%)。

各处理属水平上无显著优势菌属，最高菌属占比仅为0.03%(数据未展示)。

CK为对照，IT为添加促腐菌剂处理。

采用冗余分析(RDA)探究phoD微生物群落结构与土壤理化性质间的相关性(图5)。如图5所示，AN、MWD、OM、EC和pH为R2值最高的5个环境影响因子，表明这5个环境影响因子与土壤phoD微生物群落相关性最高。IT处理phoD微生物群落结构与MWD和AN含量呈正相关，与pH则呈负相关。成分1和成分2分别解释了phoD细菌群落96.8%和2.17%的变化。IT和CK处理被纵坐标轴完全分开，表明两个处理群落结构存在显著差异。

3 讨论

3.1 菌剂配施对小麦产量与秸秆腐解的影响

宋时丽等[14]探究水旱轮作(冬小麦-夏水稻)中秸秆还田配施腐熟复合菌剂对砂质碱性土壤生态的影响，结果显示添加腐熟复合菌剂处理小麦产量比常规处理显著提升23.8%。而盛海君等[15]发现秸秆还田时是否施加菌剂对成熟期小麦产量影响不显著，笔者研究结果与之一致。笔者发现秸秆腐熟剂在一定程度上对作物产量有促进作用，但增产效果不显著，需进一步开展长期试验研究。由此可见，秸秆腐熟剂促产效果受到农作物类型、地理环境、气候条件和土壤类型等因素限制。笔者试验中添加秸秆促腐菌剂处理秸秆腐解率在5个不同取样时间点始终高于对照，秸秆腐解率提升幅度先逐步升高，在3个月后达到最高，之后又缓慢下降，表明添加秸秆促腐菌剂有效促进了秸秆降解，且前期促进效果更明显。李本旭等[16]发现秸秆还田配合使用秸秆腐熟菌剂，第30天降解率达到49.3%，比不施腐熟菌剂处理高7.4%，笔者研究结果与之一致。

图5 土壤phoD微生物群落与环境因子的RDA分析

3.2 菌剂配施对土壤理化性质的影响

土壤团聚体水稳性能够反映土壤结构的持水性、稳定性、通透性和抗侵蚀能力，不仅是评价团聚体抵抗外力破坏能力的重要指标[17]，也是衡量土壤结构状况和肥力水平的重要指标[18]。与对照相比，添加秸秆促腐菌剂处理R0.25、MWD和土壤容重分别显著提高62.5%、46.7%和降低4.17%，表明添加秸秆促腐菌剂显著改善土壤物理结构。MWD、GMD和R0.25均是表征土壤团聚体水稳定性的重要指标，土壤团聚体水稳定性越强越有助于降低土壤团聚体破坏率，增加土壤透气性与养分固持能力，从而增强土壤微生物活性。朱敏等[19]研究表明，增施腐熟剂可有效降低土壤容重，并提升土壤有机质、有效磷等养分含量。笔者研究中添加秸秆促腐菌剂处理有机质、速效氮和速效磷含量显著提高，分别增加11.8%、59.8%和62.6%。添加秸秆腐熟剂能够促进秸秆快速腐解和释放氮磷，这是因为施用秸秆腐熟剂缩短了秸秆腐解周期，使秸秆中养分尽快释放到土壤中[20]。宋时丽等[14]研究表明，在配施化肥条件下，促腐菌剂在腐解有机物料、释放养分的同时，通过刺激有机质分解功能菌群生长和加强土壤酶活性[21]，达到在小麦生长期间有效提高土壤有机质和速效养分的效果。

3.3 菌剂配施对土壤酶活性和phoD微生物区系的影响

酶在土壤生态系统物质循环和能量转换中起着重要作用，是土壤-作物体系中养分循环的主要调节者[22]。纤维素酶活性是一种重要的碳循环指标，能将植物残体分解成葡萄糖；磷酸酶活性则是反映土壤磷素生物转化强度的重要指标。笔者试验结果显示，添加秸秆促腐菌剂处理碱性磷酸酶和纤维素酶活性分别显著提高33.8%和26.4%。这可能是由于秸秆促腐菌剂为土壤带来更多功能性微生物，加快了土壤中有机质、纤维素等大分子物质的降解速度，缓解了土壤高C/N的情况，又进一步提升了土壤微生物代谢能力[23]。这与魏赛金等[3]研究结果相仿，添加秸秆促腐菌剂能够增加秸秆腐解微生物数量，进而提高相关酶活性，促进秸秆腐解和养分释放。萨如拉等[24]在室内模拟玉米秸秆还田，发现施用秸秆腐熟剂后土壤碱性磷酸酶活性和纤维素酶活性均显著提高，添加秸秆腐熟剂提高了土壤中碳氮磷的代谢水平，从而使得各类酶活性增加。

编码碱性磷酸酶的phoD基因可以帮助土壤中微生物适应有效磷含量的波动。含phoD基因微生物代谢含磷源物质，产生碱性磷酸酶，对土壤磷循环起到促进作用[25]。Chao 1指数用于表征样本中物种数量，其数值越大表明样本中物种数越多。添加秸秆促腐菌剂处理土壤phoD微生物群落物种数量(Chao 1指数，图3)显著高于对照，有效增加了土壤phoD微生物群落物种数量。添加秸秆促腐菌剂处理Shannon指数、Simpson指数和Pielou e指数在数值上也高于对照，但差异不显著。虽然添加秸秆促腐菌剂处理phoD微生物群落门水平分类上数量与对照无显著差异，但Venn图分析表明，添加秸秆促腐菌剂处理特有phoD物种数更多，也进一步印证了秸秆促腐菌剂可促进土壤phoD微生物群落物种数量提升。HU等[26]研究表明，具有高有机质含量的有机施肥组合能显著影响phoD微生物群落，通过调节土壤碱性磷酸酶活性来促进土壤phoD基因群落生长，增加土壤磷的可获得性。让秸秆快速腐解释放更多的有机无机养分可能是秸秆促腐菌剂能提升phoD微生物群落数量的主要原因。RAGOT等[27]研究发现，pH和全氮是影响phoD微生物丰度和碱性磷酸酶的重要因子，与之相似，笔者研究发现pH、MWD和速效氮含量是驱动含phoD基因群落结构变化的重要环境因子，这表明养分供应和团聚体稳定性对含磷物质微生物矿化起重要作用。杨文娜等[5]探究土壤phoD微生物群落对化肥和有机肥配施生物炭的响应机制，同样发现pH对phoD微生物群落结构的影响最为强烈。已有研究[13]显示，碱性磷酸酶基因丰度与养分矿化有关，表明有机磷矿化是有机碳源矿化的副产物。笔者试验中，增施秸秆促腐菌剂加速了秸秆腐解速度，提高了土壤碳源和土壤phoD微生物群落物种多样性，加速了土壤磷循环，从而达到改善农田磷养分供应的目的。

4 结论

以水稻-小麦轮作系统为研究对象，发现添加秸秆促腐菌剂能够有效加速秸秆腐解，提升土壤质量，促进土壤养分转化，在提高土壤碱性磷酸酶活性以及土壤phoD微生物群落丰度和多样性的同时也提高了作物籽粒中磷含量。因此，配施秸秆促腐菌剂对提高秸秆还田的生态效益，尤其是土壤磷循环具有显著促进作用，是一种可取的生态农业模式。