植物组织培养中抗污染培养基新配方初探

杨文雅

关键词： 植物 组培 抗污染配方 培养基 红掌组培苗

现阶段，植物组织培养技术（tissue culture）属于实操性非常强的生物技术，能够分离一个或数个细胞或外植体。伴随现代科学技术的快速发展，植物组织培养技术为相关科学实验提供可靠证据，成为规模化、产量化生产种苗的广泛性方法，其凭借可人为控制、生长周期短、繁育率高和可自动化控制管理等优势，已经获得迅速普及、应用[1]。植物组织培养技术关键的技术环节在于控制污染率，而杂菌污染属于组织培养中培养基普遍存在污染问题。使用酒精和次氯酸溶液进行外植体消毒的过程，不仅消耗时间较长，同时操作流程较为繁琐，存在较大的杂菌污染风险。这种方法容易导致植物组织培养过程出现疏漏，造成培养基被污染，这些污染的来源主要是真菌、细菌、杂菌。一旦杂菌和杂菌孢子污染植物组织培养基，约5 天后，在培养基表面和培养基内部会大量出现杂菌繁殖，同时还会分泌出具备酸性的有害物质，对培养的植物进行大批污染和毒害，造成植物培苗的死亡。有鉴于此，一旦在植物组织培养实验中发生外植体杂菌污染，必须立即销毁，控制杂菌污染率。

杂菌污染抑制了植物组织培养技术在农业生产中的广泛推广和利用，对农业的发展造成了直接影响。因此，对植物组织培养基实验的细菌、杂菌抑制研究逐渐被提上日程，是未来研究的必然趋势。该实验前提是节约实验室资源，以红掌组织培养为实验材料，添加银粒子到培养基中，观察培养基的生长情况以及抗杂菌污染效果，并对其中的组织实验变化情况加以详细的记录与分析对比，获得实际的、完整的组织实验成果研究数据。以此探索一种成本低廉可靠、可以高效抵抗杂菌污染的抗污染配方及方法[2]。

1 實验背景

以往的植物组织培养实验过程中，不同的植物自身带有一定的细菌，这些细菌多种多样，所以为植物进行杀菌工作十分繁琐与困难。如果没有彻底地对植物携带的细菌进行杀除，就会将其带进植物的培养基以内，导致培养基内发生杂菌的污染问题。这些不稳定因素，均会导致培养基污染的产生，会使实验研究的植物组织培养基实验数据造成偏差，导致实验无法进行[3]。

随着时代的变化，对植物培养基中的杂菌进行控制的科学技术手段也在不断更新。通过实验与探索，发现植物组织开放式的培养方式让植物可以在开放式的载体中生长与变化，有效抑制杂菌产生。与此同时，可以对植物组织的培养工作加以简单化转换，从而降低实验难度，节约植物组织实验的经济消耗成本，促进相关实验成果的发展。此外，如果将有明显控制作用的新配方抗污染制剂加入，将促组织培养具备更高培养价值。

2 材料与方法

2. 1 实验材料

2.1.1 实验试剂

利用不同的实验试剂，如硝酸银AgNO3、果糖、葡萄糖等。

2.1.2 实验仪器

透射电子显微镜Transmission Electron Microscope，日立H-7650。

2.1.3 外植体材料及其生物学特性

红掌组培苗及种子。红掌（Anthurium andraeanumLinden）别名火鹤花、红鹅掌、安祖花和红烛等。红掌以独特的风姿给人以热情、进取之感，属于热带花卉名种，品种繁多，可以作为切花栽培，也可以作为盆花栽植。在规模化、产量化生产种苗的过程中，通常采用植物组织培养方式进行快速繁育，植物组织培养红掌组培苗及种子是否能够成功，是红掌规模化、产量化育苗的关键环节。红掌原产于热带雨林区，喜欢温暖、潮湿的环境，生长对于温度的要求较为严苛，通常适宜在20 ℃～30 ℃的环境存活，喜欢阳光但严格禁止被阳光直射，防止叶片、花苞片因为高温产生灼伤、褪色，失去光泽，叶片生长缓慢。

2.1.4 实验时间

2020 年3 月至2020 年12 月进行。

2. 2 制备植物组织培养基

2.2.1 纳米银溶胶的制备

在温度40 ℃以下时，硝酸银溶液浓度分别达到1.0×10?4、1.0×10?3、1.0×10?2时，分别在25 mL 硝酸银溶液中加入5 mL 氨水溶液，同时将三口瓶分别置放于磁力搅拌器上进行均速搅拌，在溶液充分混合之后，分别再加入10 mL 的果糖溶液、5 mL 的葡萄糖溶液，静置1 min 后，滴入0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液，然后进行混合调节，调节要达到整个溶液的酸碱度为9 左右的pH值，具体反应需要满足1.5 h。

2.2.2 纳米银粒子的表征

就纳米银粒子的表征而言，可以对细菌进行充分的抑制与消杀，并且不需要任何的化学或其他辅助成分的帮助。可以用于人们日常生活中的细菌消杀，对人们的健康防护具有一定的作用。在使用纳米银粒子的过程当中，只需要微量的粒子，就可以产生十分有效的杀菌作用，对细菌的生长、繁衍与转变具有较大的抑制能力。有鉴于此，人们开始研究将其加入到植物组织的培养基实验之中，是否能对细菌的生产产生较大的抑制影响，增加培养基的抗菌能力，从而对在植物组织培养基的实验产生一定的推动作用，抑制杂菌生成。

该文实验中主要利用果糖和葡萄糖为还原试剂，实验在室温下，水相体系中还原硝酸银溶液之后得到纳米银溶胶。在实验进行的过程中可以发现，实验试剂颜色、粒子的大小、粒子的散落位置情况都出现了不同的变化。并在此过程之中，研究综合性、整体性的变化与影响，从而给出结论。同使用有机溶剂作还原试剂的实验相对比而言，在该实验中使用果糖和葡萄糖更加具备环保属性，绿色健康，而且果糖和葡萄糖可以同时作为植物组织培养基的能量来源物质，所制备出来的纳米银粒子可以添加到B5 培养基之中，在实验中可以测试该复合培养基的具体抗菌性能[4]。

2.2.3 纳米银粒子复合B5 培养基制备

把3.02 g 的B5 干粉培养基溶解在100 mL 的去离子水之中，加热到完全溶解，然后向去离子水中加入10 mL 的纳米银粒子的溶胶，再倒入洁净的表面器皿之中。

2.2.4 最佳抑制杂菌配方对红掌组培苗及种子生长的影响

为了验证最佳抑制杂菌配方对红掌组培苗及种子生长的影响，配制含有该配比配方培养基，同时配比更高浓度梯度的培养基，以不含纳米银粒子抑菌制剂的培养基为空白对照。

（1）采集与消毒。

采集红掌组培苗根、茎、叶、花、芽及种子的子叶，也可以利用花粉粒和花药，培养无病毒苗采用茎尖分生组织部分，长度约为0.1 mm。将红掌组培苗茎尖分生组织部分用流水冲洗干净，用蒸馏水冲洗后，使用无菌纱布将水分吸取干净，使用消毒刀片将红掌组培苗茎尖分生组织部分切成小块。在无菌实验环境中，将红掌组培苗茎尖分生组织部分放置进入70% 酒精或次氯酸溶液中进行浸泡。30～60 s 后将红掌组培苗茎尖分生组织部分移动至装有漂白粉的饱和液中，或置放在汞水中消毒10 min，最后在取出时，使用无菌水进行冲洗，冲洗3～4 次后晾干备用。

（2）外植体制备。

使用消毒后的无菌刀、剪子和镊子等，在无菌实验环境下进行嫩枝外皮、种皮胚乳等的剥除。在外植体制备过程中，严格禁止实验人员触碰实验用红掌组培苗及种子。

（3）接种与培养。

在无菌实验环境下，将已经切好的外植体接种在培养基上，每排培养基点播72 个外植体，每次处理重复8 次。成功接种后，使用无菌胶带对培养皿进行封口，设置培养基处24 ℃温度，湿度达到55%，要求每天记录红掌植株的生长情况与污染情况。外植体增值是植物组织培养关键，为扩大增值系數需要进行继代培养。

2. 3 抗杂菌的性能测试

将纳米银溶胶添加到B5 培养基之中，然后把红掌外植体放置在复合培养基上进行培养，伴随培养基表面出现杂菌，将已经被污染的红掌外植体组织置于1 500～2 000 lx 光照强度下，每天光照14 h，温度保持在25 ℃左右[5]。

3 结果与分析

3. 1 纳米银粒子的主要表征

就纳米银粒子的主要表征而言，可以将纳米银粒子应用在植物组织的培养基实验当中，在进行实验反应的具体过程之中可以发现，伴随着实验反应的产生，纳米银粒子在制备反应开始前和开始后，其实验反应开始出现不同的改变，其颜色的呈现最终变化成为了棕黄颜色：

这主要是因为纳米银粒子的表面等离子体产生了共振引起。

不同的硝酸银浓度下制备纳米银粒子时，制备出的纳米银粒子表现为并不规则的球状形状，且保持较好的分散性。一旦硝酸银的浓度达到：1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L；制备出的纳米银粒子对应的平均粒径可以分别达到48 nm、55 nm、66 nm，将实验之中的数据信息参数加以详细的记录，并在实验完毕后，将这3 种浓度的硝酸银浓度进行对比，发现当硝酸银的浓度达到1.0×10?2 mol/L 时所制备出的纳米银粒子出现了块状银颗粒，同时块状的银颗粒的粒径分布范围比较宽，平均的宽度分布在45～98 nm 之间：

3. 2 具体抗菌性能测试

将红掌处于两种不同参数的B5 培养基上的培养状态进行数据比较之后可以了解到，在进行实验的第5 天，没有添加纳米银溶胶的实验培养基之中，红掌表面和琼脂进行接触的周围存在大量的霉菌和杂菌，同时，培养基表面也大量产生霉菌和杂菌；与这样的结果有所不同，复合纳米银粒子B5 培养基没有发生新型的细菌变化和生长，而当红掌进行实验过后，其红掌的实验结果显示发生少数的表皮变化。实验数据表明，纳米银粒子可以对不同的细菌产生较强的、十分有效果的抑制与抵抗作用，具有明显的控制杂菌和霉变的效果[6]，其可以运用在植物组织培养基实验中，推动相关实验得以顺利进行。

受杂菌污染干扰，将造成红掌组培苗及种子的组织培养质量迅速下降，而现有抗污染技术过于强调无菌操作环境，虽然能在一定程度上减少污染，但是成本相对较高。在实验的准备过程中，需要采取绿色、无毒的操作方法通过科学的实验配比方法，对其按照稳定流程进行实验，并将实验数据加以详细的数据信息记录，并在实验完毕后，对其进行准确的分析[7]。

在该次实验中，实验主要应用的原料为硝酸银，以果糖和葡萄糖作为还原试剂。一旦硝酸银的浓度分别达到1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L时，所制备出的纳米银粒子平均粒径分别处于48 nm、55 nm、66 nm，鉴于此，将纳米银粒子科学添加到B5 植物培养基中，可以得到复合培养基，具有显著的抗杂菌性能[8-9]。

4 结语

在进行植物组织培养的实验过程之中，探索对环境没有污染，并且成本较低的优良解决方法。该实验进行了一种植物组织培养基抗杂菌污染的配方配比制备方法，需要对其原有的液体进行一定的还原处理工作，再将处理过后得到的新型粒子加入到内含植物组织的载体，也就是培养基之中，得到一种对杂菌性质具备一定抗体能力的复合培养基，利用现有的科学技术手段，对培养基内的污染因子加以管理和控制。该次实验主要添加蔗糖作为能源物质，全部实验过程无污染、安全绿色，并且具有成本小、经济适用的特点，属于一种可以进行全面推广应用的纳米银粒子制备配比配方，能够有效抑制真菌、细菌、杂菌生长，实验的制备方法简单可靠、容易操作，对植物无害，制备出的纳米银粒子粒径非常均匀，而且颗粒的大小合适，同时状态分布均匀。该实验中的纳米银溶胶和红掌组培苗及种子培养基的相容性明显适合，该实验有利于优化红掌组培苗及种子灭菌保存效果，添加了纳米银溶胶的培养基具备较好的控制杂菌效果。