油茶叶斑病病原菌的分离、鉴定与室内毒力测定

廖 凯，郝亚伦，金晨钟,2，郭开发,2，郭 军,2，陈 苗

（1.湖南人文科技学院农田杂草防控技术与应用协同创新中心，农药无害化应用湖南省高校重点实验室，湖南 娄底 417000；2.娄底市农业科学研究所，湖南 娄底 417000）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）以其茶油、茶籽、茶壳、茶叶、茶根等保健功效而著称[1]，其中茶油对心脑血管、高血压、高血脂有一定的抑制作用[2]。目前全国油茶种植面积达453.3 万hm2，湖南油茶种植面积、茶油产量和产值均居全国第一[3]。然而油茶在栽培生产中，随着种植面积的不断增加，种植品种不断增多，油茶叶斑病[4]和炭疽病[5]发生越来越严重。油茶叶斑病主要危害叶片，病斑由小到大呈不规则状，红褐色至灰褐色，病健界限明显，病斑处凹陷，病叶常提早脱落，新梢出现枯死现象，导致油茶产量大幅下降。前人对油茶叶斑病的病原菌进行分离鉴定，有的鉴定为拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis kenyana）[6]，有的鉴定为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）[4,7]。笔者从双峰县油茶基地采集了7 份油茶叶斑病病叶样本，采用组织分离法从中分离纯化获得3 株病原菌，进行形态学观察、分子生物学鉴定及致病性检测，旨在明确油茶叶斑病的病原菌种类，并通过带毒介质菌丝生长速率法测定该病原真菌对6 种药剂的敏感性，为油茶叶斑病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021 年4 月在湖南娄底市双峰县洪山殿镇油茶基地采集油茶叶斑病样品，共采集样品7 份。病斑近圆形，红褐色至灰褐色，病健界限明显，病斑处凹陷。将采集的病叶用封口袋装好带回实验室进行分离培养。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化采用组织分离法[8]取典型叶斑病叶片用75%乙醇擦拭表面并风干，于病健交界处切下5 mm×5 mm 小块，在超净工作台用1%次氯酸钠消毒1 min，用无菌水冲洗3 次后，用滤纸吸干表面水分，接种到PDA 平板，在培养箱中培养2 d 后，在WA 平板上进行单孢纯化，将纯化后获得的菌株保存在PDA 斜面上，置4℃冰箱中储存备用。

1.2.2 病原菌形态学特征观察将病原菌用PDA 培养基在25℃恒温条件下培养10 d，采用压片法，对菌落形态、色泽、大小分生孢子的特征进行观察，测量分生孢子的大小等。参照张天宇[9]的方法在显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗及喙状细胞的形态，并观察成链情况。

1.2.3 分子鉴定依据形态学鉴定结果，挑选代表菌株在PDA 平板上培养5 d 后，采用DNA 提取试剂盒提取病原物的DNA，采用引物ITS1/ITS4[10]和EF1-983F/EF1-728[11]进行PCR 扩增。PCR 反应体系（50 μL）：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）25 μL，ITS1/EF1-983F 2 μL、ITS4/EF1-728F 2 μL、DNA 模板1 μL，ddH2O 20 μL。ITS基因序列PCR扩增反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 个循环；72℃延 伸10 min。EF1-α基 因 序 列PCR 反 应 程 序 为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 个循环；72℃延伸10 min。反应完成后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 反应产物。将不同引物的 PCR 反应产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序后的基因序列经校正后，在GenBank 中进行同源序列搜索（BLAST），比较供试菌株与现有数据库中相应序列的同源程度。利用MEGA 5 软件构建系统树。

1.2.4 致病性测定采用菌饼贴接法[12]测定病原菌的致病性。采集健康油茶叶片用75%酒精进行表面消毒，用灭菌的打孔器（φ=5 mm）在培养菌落打取菌饼，将打好的菌饼贴接在油茶叶片处，以不接种病原菌的PDA 培养基菌饼作为空白对照接种健康油茶叶片，每个处理重复5 次。将接种好的油茶放在铺有湿润灭菌滤纸的保鲜盒中，叶柄处用无菌湿润的脱脂棉包裹，置于人工光照气候箱中培养。每天观察病斑生长情况，5 d 后量取病斑直径，进行拍照记录。

1.2.5 病原菌室内毒力测定采用菌丝生长速率法进行杀菌剂室内毒力测定。供试杀菌剂为5%己唑醇悬浮剂、45%咪鲜胺水乳剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、43%戊唑醇悬浮剂和75%百菌清可湿性粉剂。在预试验的基础上，将6 种药剂原药各设置成5 个对应浓度梯度（500 倍、1 000 倍、2 000 倍、4 000 倍、8 000 倍），分别吸取不同浓度的化学药剂滴入PDA 培养基的培养皿中，混匀，冷却凝固备用，每个浓度梯度3 个重复。以加入等量无菌水的PDA 平板为对照。用灭菌的打孔器（φ=5 mm）打取培养好的病原菌菌饼 1块，接种到上述PDA 平板中央，置于25℃恒温培养箱中培养7 d。采用十字交叉法测定菌落直径，计算菌丝生长抑制率，求出毒力回归方程，进一步算出 EC50值及相关系数。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态特征

从采集的7 份油茶叶斑病中分离得到3 株分离物，分离物菌落为圆形灰褐色或灰绿色，边缘整齐，菌落背面灰褐色（图1A、B）；菌丝大多数呈卷曲交织的绒毛状，气生菌丝发达致密，生长迅速，5 d后菌落直径达8.5 cm，长满整个培养基；分生孢子黄褐色或褐色，长椭圆形、卵形、棍棒状或倒梨形（图1C），砖隔孢，横隔膜1～6 个，竖或斜隔膜0～3个，孢子长4.0～61.5 μm，宽3.8～25.4 μm，有的孢子有2.0～16.0 μm 假喙（图1D）。根据形态特征初步鉴定为链格孢属。

图1 分离所得病原菌的形态特征

2.2 分子生物学鉴定

利用ITS基因序列对该病原菌进行PCR 扩增，经电泳检测分别获得大小约为500、250 bp 的清晰条带，然后将测得的序列登录NCBI 进行BLAST 比对，3 株病原菌的28S rRNAITS序列（登录号分别为MZ664270.1，MZ664271.0，MZ664272.1）与已登录的Alternaria alternata菌株（登录号依次为KP900243.1、MZ160955.1）相似性达99.63%以上。采用MEGA7进行系统发育分析，通过自展法（bootstrap）构建系统发育树（图2），YCB 菌株与Alternaria alternata菌株处于同一个分支上，相似性较高。最终，结合形态学特征、28S rRNAITS序列分析，确定引起油茶叶斑病的病原物为Alternaria alternate。

图2 各代表菌株基于ITS序列构建的系统发育树

2.3 致病性测定

将分离所得病原菌离体接种到健康油茶叶片上，接种5 d 后，接种部位出现灰白色水渍状病斑，接种10 d 后，接种部位中间为灰白色，边缘为黑褐色病斑，试验接种症状与田间症状一致，空白处理未发病（图3）。而且从发病病斑上可重新分离到相同的病原菌。

图3 病原菌对健康油茶叶片的致病性测定

2.4 病原菌室内毒力测定

由表1 可知，6 种化学药剂的EC50值由大到小排列依次为70%甲基硫菌灵可湿性粉剂＞75%百菌清可湿性粉剂＞5%己唑醇悬浮剂＞43%戊唑醇悬浮剂＞10%苯醚甲环唑水分散粒剂＞45%咪鲜胺水乳剂，油茶叶斑病菌对后4 种化学药剂表现敏感，其中油茶叶斑病菌对药剂45%咪鲜胺水乳剂最为敏感，其EC50值为0.521 5 mg/L，对药剂70%甲基硫菌灵可湿性粉剂最不敏感，其EC50值为9 021.94 mg/L。

表1 供试杀菌剂对油茶叶斑病病菌的毒力回归方程和EC50值

3 结论与讨论

已有文献报道，引起油茶叶部病害的病原菌有Lasiodiplodia theobromae[13]、Nigrospora sphaerica[14]、Colletotrichum gloeosporioides[15]、Colletotrichum henanense[16]。特别是炭疽菌属Colletotrichum真菌危害林木、果树、蔬菜、花卉、药用植物和大田作物的根、茎、叶、花、果实和幼苗，可导致植株枯萎、果实腐烂、叶片病斑等症状，造成严重经济损失[17-18]。为了明确湖南丘陵地区油茶叶斑病的病原菌种类，研究在双峰县洪山殿镇油茶基地采集了7 份油茶叶斑病样品，采用组织分离法从中分离、纯化获得3株病原菌，通过形态学观察、分子生物学鉴定及致病性检测，证实该病原菌与交链格孢Alternaria alternata基本一致，扩增得到的rDNA-ITS基因序列与交链格孢Alternaria alternata序列的同源性高达99.63%；在构建的系统发育树上，该病原菌也与交链格孢Alternaria alternata聚在同一个分支上，结合致病性测定试验，可将该病原物鉴定为交链格孢Alternaria alternata。

链格孢菌属菌株大多数兼性寄生在植物（农作物、经济作物和果树林木等）上，可占领其他病原物造成的病斑位点、受损部位或其他衰弱组织等，加重其他病害的发生，造成严重的经济损失[19]。链格孢属下种类多，属级特征醒目而种级特征变异较大，单纯根据形态特征进行种类鉴定和区分难度较大，甚至存在争议，因此结合分子生物学手段进行种类鉴定可使鉴定结果更为可靠。

为有效防治油茶叶斑病，该研究还进行了病原菌室内毒力测定试验。结果表明，5%己唑醇悬浮剂、45%咪鲜胺水乳剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、43%戊唑醇悬浮剂4 种药剂对油茶叶斑病病原菌具有不同程度的抑菌效果，可用于油茶叶斑病的化学防治。其中，油茶叶斑病菌对药剂45%咪鲜胺水乳剂最为敏感，其EC50值为0.521 5 mg/L；对药剂70%甲基硫菌灵可湿性粉剂最不敏感，其EC50值为9 021.94mg/L。