骨痹消巴布剂中祖师麻甲素高效液相色谱法含量测定

敖 利* 宋 健

（重庆市中医院，重庆 400021）

骨痹消巴布剂是由祖师麻、白芍、当归、伸筋草等十几味中药组成的中药复方制剂，具有活血通络、散寒镇痛、祛风除湿、补肝强肾的功效，临床上用于治疗退行性骨关节病及其他关节类疼痛病症。骨痹消巴布剂是我院骨科医师的经验方制剂，从前制为熏洗液在临床上应用多年，对治疗退行性骨关节病及其他关节类疼痛病症有很好的疗效，但临床运用比较局限，患者使用携带不方便，因此将此制剂改进为更方便，更新的剂型。本课题对传统经验方剂型进行改进，主要进行制剂工艺、质量、体外释药评价、药理等实验研究，研究治疗骨关节病的经皮给药新剂型巴布剂，并对拓展中药内病外治思路、探索中医药特色治疗适应技术和中药特色新制剂进行有益尝试。方中主药祖师麻为瑞香科植物唐古特瑞香的茎皮和根皮，治疗风湿痹痛、关节疼痛、关节炎等疗效确切，其主要药效成分为祖师麻甲素又称瑞香素（daphnetin，7，8-二羟基香豆素），瑞香苷（daphnin，7，8-二羟基香豆素-7-β-D-葡萄糖苷），皂苷等[1-5]。药理实验研究表明，祖师麻甲素具有消炎、镇痛、抗凝、抗血栓等作用。为更好控制该制剂质量，以祖师麻所含的主要有效成分之一祖师麻甲素含量为考察指标，建立祖师麻甲素高效液相色谱含量测定方法，并进行了方法学研究[6-11]。

1 材料与仪器

仪器与试药：Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；MS-104S型电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Thermo Genepuer UF超纯水仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Eppendorf Research plus 移液器（德国艾本德公司）；AS10200A型数控超声波清洗器（天津奥特芬恩斯仪器有限公司）；TGL-16G台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；HH-S11-2-S型电热恒温水浴锅（上海百典仪器设备有限公司）。对照品：祖师麻甲素（瑞香素）Daphnetin 10900-201607（中国食品药品制定检定院）；水（超纯水）；甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯（Sigma公司）；骨痹消巴布剂（本课题组制备，20191016，20191017，20191018）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性 试验色谱柱：Agilent ZORBAX TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸（20∶80）；检测波长：327 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min；紫外检测器；样品进样量：10 μL。在此色谱条件下，祖师麻甲素与样品中其他组分色谱峰可基线分离，阴性对照在祖师麻甲素色谱峰处无相应峰出现；祖师麻甲素的保留时间为19.17 min。色谱图见图1。

图1 骨痹消巴布剂高效液相色谱图

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称定祖师麻甲素5.4 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得（每1 mL含祖师麻甲素54 μg）。

2.2.2 供试品溶液 取骨痹消巴布剂除去背衬，剪碎，混匀，取5.0 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声处理60 min（频率40 kHz，功率250 W），滤过，转至50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取一定量置于5 mL离心管中，以4 000 r/min的速率离心5 min，用孔径为0.22 μm的微孔滤膜滤过后直接进样。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例及制备工艺，配制不含祖师麻药材的阴性样品，再按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取祖师麻对照品溶液（浓度54 μg/mL），依次进样2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，记录色谱图。以祖师麻甲素的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。以进样质量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=4001.4 X+11.182，r=0.9997。结果表明，祖师麻甲素进样量在0.108～0.540 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 精密吸取祖师麻甲素对照品溶液（0.027 mg/mL）10 μL，重复进样5次，测定祖师麻甲素峰面积，其RSD=0.98%。

2.3.3 稳定性试验 按2.2.2项下方法制备骨痹消巴布剂（批号20191018）供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h准确吸取该溶液10 μL注入色谱仪，测定峰面积，其RSD=0.74%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4 重现性试验 取同一批样品（批号20191018），按2.2.2项下方法分别制备5份供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，测定祖师麻甲素的峰面积，其相对标准偏差RSD=2.80%，说明本方法重现性好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知量的供试品2.5 g（祖师麻甲素含量0.238 mg/g），置具塞锥形瓶中，再分别精密加入一定量的祖师麻甲素对照品溶液，按2.2.2项下供试品溶液制备方法制备待测溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.3.6 样品含量测定 取3批供试品，每批各取3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。用0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算样品中祖师麻甲素含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

关节退行性骨关节病（osteoarthrosis，OA）是一种关节软骨变性退化、骨质增生为特征的，多种病因引起的关节退化、膝关节周围软组织退变所致的慢性退行性关节病。目前尚无药物可使骨性关节炎的病程逆转和停止。OA患者的临床症状主要表现为关节肿胀、疼痛、畸形、功能障碍，属祖国医学骨痹的范畴，其发病机制为风寒湿邪侵袭，阻闭经络，筋骨郁结，或劳损外伤，气血瘀滞，或年老体虚，肝肾不足，骨痿筋驰，筋骨失养。临床发病特征为女多于男，可能与女性绝经后雌激素分泌下降有关。OA是骨科常见病、多发病，也是中老年人的常见病。随着近年来人口老龄化趋势的发展，其发病率也明显升高，对人类健康危害越来越大。我国现有65岁以上老年人已达1.5亿，国内调查该病发病率为3%～9%。其治疗包括药物内外治疗、功能锻炼、理疗、关节腔内治疗等。由于中老年人自身生理功能的衰退以及并发的其他脏器的疾病，往往限制了内服药的使用。

传统中医骨伤科所用的中草药外用剂型为数不少，主要是水剂、酊剂、膏剂、散剂、油剂、搽剂、洗剂等，随着药物剂型的现代化研究，药用高分子材料的发展，一种新型的外用药物剂型——巴布剂因其方便临床用药并使药物发挥最佳疗效的优点开始引起药剂研究人员的重视。巴布剂是将药物、药材提取物加入水溶性高分子材料基质，经炼和、涂布、剪切等工艺制成的一种载药量大，透皮效果好的透皮吸收制剂。巴布剂使用方便，适宜治疗不宜口服药物或口服药物无用的疾病，避免药物在胃肠道的降解，减少药物作用的个体差异，且一次用药即可以长时间恒定速率进入体内，有长效，缓释的优点。巴布剂还有很多优点：载药量大，非常适合中药多组分、大剂量的用药特点；与皮肤相容性好，易透皮吸收，透气性好，保湿性好，刺激性小，可反复敷贴，增加患者依从性；用药安全，方便治疗，剂量准确，面积固定，血药浓度平稳；生产无有机溶媒污染，环保。因此，巴布剂是有很好发展前景的外用中药新剂型。

外治法名著《理论骈文》明确指出“外治之理，即内治之理，外治之药，每即内治之药。所异者，法耳。”并认为“膏可统治百病”。骨痹消巴布剂是中药经皮给药制剂，符合中医“内病外治”的理论，用于治疗OA这种中老年人常见病慢性病，药物可直接作用于穴位或患病部位，并通过渗透作用经络吸收，进入血液循环到达脏腑病所，发挥药物归经治疗功效。本方经临床和药理学初步验证，可通过降低炎性细胞因子水平对骨关节炎起治疗作用，减轻膝骨关节炎关节软骨的病理损伤，对关节软骨有保护作用。骨痹消巴布剂经皮给药可避免口服药物对肠胃的刺激和肝脏的首过效应，一次用药可长时间恒定速率进入体内，维持血药浓度平稳无峰谷现象，患者使用方便安全有效。本品是中药复方制剂，成分复杂且用药剂量较大，巴布剂载药量大，可容纳中药复方的极细药粉，提取药等，让中药多种成分共同发挥治疗作用。因此将有中医理论指导、疗效好的中医经验方剂型改进为新型的经皮给药中药剂型，拓展中药内病外治思路、探索中医药特色治疗适应技术和中药特色新制剂。

巴布剂制备工艺主要包括基质成型和制剂成型。基质主要有黏着剂：聚丙烯酸钠、卡波姆、明胶、西黄耆胶、CMC-Na；填充剂：高岭土、氧化锌、微粉硅胶；保湿剂：甘油、丙二醇、聚乙二醇；渗透促进剂：氮酮、桉叶油。制剂成型工艺的影响因素主要有：搅拌炼和速度时间、炼和温度、添加顺序。巴布剂的质量评价：有感官评价和仪器检测评价，仪器检测指标有：药物黏着性、赋型性、稳定性、皮肤刺激性、药物释放度等。方中主药祖师麻含有香豆素类、黄酮类、二萜类、木脂素类等有效成分，其中主要有效成分祖师麻甲素为羟基香豆素类，易溶于甲醇、乙醇等[12-15]。供试品制备采用甲醇提取，比较了回流与超声提取，选用甲醇超声提取1 h，便捷快速。流动相的选择，比较了甲醇-0.5%醋酸，甲醇-0.5%磷酸，结果表明醋酸、磷酸均可抑制祖师麻甲素中酚羟基的解离，磷酸效果更好，峰形尖锐对称，因此选用甲醇-0.5%磷酸（20∶80），祖师麻甲素色谱峰与杂质峰基线分离，峰形好，保留时间适中。柱温的选择，比较了柱温30 ℃、35 ℃、40 ℃的色谱图，选用40 ℃柱温，柱压降低，出峰时间适中，分离度较好。

本文方法样品处理简单，回收率好，快捷准确，可作为骨痹消巴布剂质量控制的依据和方法。