甜瓜雄花外植体贮藏条件对花粉特性及授粉效果的影响

李 肯，武云鹏，彭冬秀，张 伟，张若纬*

（1.天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所/蔬菜种质创新国家重点实验室/天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室，天津 300381；2.天津市农业科学院蔬菜研究所，天津 300381）

甜瓜（Cucumis melonL.）属葫芦科甜瓜属一年生草本植物，是典型异花授粉的瓜类作物。甜瓜的花器官分为雌花、雄花和两性完全花，通过不同基因型的调控，植株可分为雄花完全花株、雌雄异花同株、全雌系株，目前我国育种生产应用的绝大多数材料都属于雄花完全花株和雌雄异花同株。花器官作为植物遗传史中最为重要的承载工具，在繁殖育种与种质资源研究工作中起着不可或缺的作用[1]。在广义生物学功能上，雌性卵细胞与雄性精细胞结合后方能繁衍，这一过程始于传粉、受精，从而形成种子并加以传播。因此，花粉的作用不可小觑，其直接影响杂交育种的效率与进程。在花器官的发育过程中，花粉的活性和萌发率也随之变化。有研究表明，在自然开花条件下，甜瓜的雄花或完全花雄蕊散粉数小时后，花粉会逐渐失去活性，花粉萌发速度和萌发率也随之降低[2]。黄玉源等利用TTC 染色对南瓜成熟花粉粒进行活性鉴定，发现6:00 时花粉活性达到最高，且授粉1 h 后花粉粒迅速萌发[3]。在对西瓜花粉特性的研究中发现，花药在晴天6:00 时开始散粉，8:00—9:00 花粉活性达到最高，随后逐渐降低，温度越高降低速率越快[4]。因此，花粉活性可能与花药组织的适应环境相关，尤其对于温度、湿度极为敏感。目前对花粉的研究大多围绕已散粉的贮存条件展开，对未开放花药组织受贮存条件的影响鲜见报道。

甜瓜具有明显的杂交优势，且绝大多数材料雄花开放时间均早于雌花或完全花，因此甜瓜的杂交育种鲜见亲本花期不遇的问题。在甜瓜制种时，由于工作量大，育种单位习惯性在开花前一天收集未开放雄花并置于贮存容器中，待第二天自然散粉时进行授粉。我们在收集雄花的过程中发现，不同的贮存条件对着果率和结籽量有明显影响。可见，在杂交工作前开展花粉活性及萌发率测定尤为重要[5]。本研究通过测定核心杂交父本材料的雄花在自然开放条件下花粉活性和萌发率，以探究棚室环境对着果率和结籽量的影响。开花前一天收集雄花，通过不同的条件贮存未开放的雄花外植体，以探究温度、湿度和光照对授粉效果的影响，为杂交育种前期工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

厚皮甜瓜自交系‘22S131’：雄花完全花株，核心杂交父本材料；厚皮甜瓜自交系‘22S146’：雄花完全花株，杂交母本材料；厚皮甜瓜自交系‘22S201’：雌雄异花同株，杂交母本材料。以上材料均由天津市农业科学院蔬菜研究所甜瓜研究室提供。

1.2 自然条件下的花粉特性分析

所有试验均在天津市农业科学院武清创新基地进行。在‘22S131’盛花期的晴天，待植株的雄花自然散粉后，用镊子摘除雄蕊，置于硫磺纸上，带回实验室后收集花粉并进行花粉活性和花粉萌发率测定。试验设3 次重复，以5 棵‘22S131’植株为供试材料，每棵植株取发育正常的2 朵雄花，分别用于花粉活性和花粉萌发测定。自刚刚散粉起，每隔1 h 采集1 次，同期记录采集时棚室温度和湿度。

1.3 自然条件下的结实特性分析

以‘22S131’为父本，‘22S146’和‘22S201’为母本，分别做杂交处理。母本以5 棵植株为单位仅做1 次杂交，自刚刚散粉起，每隔1 h 授粉1 次。‘22S146’做去雄处理，每次授粉2 朵并去除剩余雌花，‘22S201’则省略去雄环节，其余均相同。授粉后按常规田间栽培方法进行管理，授粉15 d 后定瓜，50 d 后果实采收采种，记录坐果与结籽情况，取5 棵植株平均值计算着果率与结籽量。

1.4 不同贮存条件下的花粉特性和结实分析

在开花前1 d 的16:00 采集‘22S131’的雄花，用硫磺纸进行包裹，带回实验室培养箱中贮存。试验采用单一变量法，设3 次重复。为探究温度的影响，采用定量长光照、80%湿度，设25、15、5 ℃三个温度处理，自刚刚散粉起1 h 后，取花粉样品，测定花粉活性和萌发率。湿度影响采用同样方案，定量长光照、25 ℃，设干燥、40%、80%三个湿度处理，其中干燥处理先将雄花置于密封干燥罐再置于培养箱中，40%和80%湿度则省略干燥罐环节。光照影响采用定量25 ℃和80%湿度，设长光照和长黑暗两个处理。着果率及结籽量测试采用“1.3”的方案，以各处理的‘22S131’花粉为父本，‘22S146’为母本做杂交处理，散粉饱和后仅授粉1 次，均授20 棵，取平均值计算着果率与结籽量。

1.5 花粉活性测定

采用TTC 染色法进行花粉活性测定。用镊子取少量的花粉置于载玻片上，加入1 滴0.5%TTC 溶液，均匀搅拌使花粉粒完全扩散，盖上盖玻片，整体置于培养皿中，在阳光下照射15 min 后镜检，活性高的花粉粒会被染成红色，随着活性降低，颜色也会变淡，没有活性的花粉粒无法着色。选取5 个视野，记录花粉粒总数和完全染为红色的花粉粒数，取平均值计算花粉活性。

1.6 花粉萌发率测定

采用液体培养基培养花粉，利用显微镜检测其萌发率。在双凹孔载玻片中滴入培养液，用毛笔均匀剥落花粉，将载玻片置于底部覆有湿滤纸的培养皿中，在28 ℃恒温箱中培养。液体培养基选用添加蔗糖+硼酸，蔗糖设0、50、100、150 g·L-1四个梯度处理，硼酸设0、50、100、150 mg·L-1四个梯度处理，培养时间设2、4、8 h 三个阶段，通过不同的添加物浓度组合筛选出适于花粉萌发的最佳培养基类型及培养时间。采用TTC 染色法对花粉进行镜检，当花粉管长度超过花粉粒直径时，视为花粉萌发成功。选取5 个视野，记录萌发花粉数、总花粉粒数，取平均值计算花粉萌发率。

2 结果与分析

2.1 花粉萌发培养基类型及培养时间筛选

培养基花粉萌发结果如表1 所示，培养基中不同浓度的蔗糖和硼酸及培养时间对花粉萌发有显著影响。在无添加物的条件下，‘22S131’的花粉萌发率最低，最高值仅为59.1%，因此蔗糖和硼酸对花粉萌发有一定影响。相同蔗糖浓度的条件下，花粉萌发率随着硼酸浓度增加而升高，而相同硼酸浓度条件下，随着蔗糖浓度增加，花粉萌发率呈现先升高再降低趋势，当蔗糖浓度为100 g·L-1、硼酸浓度为150 mg·L-1时，花粉萌发率最高，可达到94.9%。在相同蔗糖与硼酸浓度条件下，随着离体培养时间增加，花粉萌发率呈现先升高而后平稳趋势，从开始培养至培养4 h，花粉萌发率逐渐升高，而培养8 h 与培养4 h 无明显差异。综上所述，本试验选择100 g·L-1蔗糖与150 mg·L-1硼酸作为最优培养基添加物，选择4 h作为离体培养时长，从而探究其他处理对花粉萌发的影响。

表1 甜瓜花粉萌发试验结果

2.2 自然开花条件下的花粉活性及萌发率变化

根据统计，测试当天的‘22S131’平均每棵植株上同时开放3 朵雄花，随着时间的推移，温度、光照逐渐升高，湿度逐渐下降，花粉活性呈现上升、平稳、急剧下降的变化过程。6:30 雄蕊逐渐开始散粉，7:30 达到完全开放，花粉呈现饱满状态，11:30雄花整体出现萎蔫，雄蕊底部出现组织液外渗，至13:30花粉被完全浸湿，呈现黏着状态。花粉活性测定结果显示，散粉初期为82.14%，完全开放时达到最高（94.66%），至10:30 无明显差异，11:30 迅速降低至62.35%，随后持续降低，至14:30达到4.12%（见图1）。从温湿度变化过程分析，上午棚室温度呈平缓上升状态，湿度呈下降状态，而11:30 棚室温度急剧升高，湿度急剧下降，因此高温低湿可能是花粉活性急剧降低的主导因素。由图1 可知，花粉萌发率变化趋势与花粉活力大致相同，在7:30 达到峰值，随后逐渐降低，在6:30 刚刚散粉时，花粉活力和萌发率差异明显。未达到饱和状态的花粉不能完全发育。

图1 甜瓜自然散粉后的花粉活性和萌发率变化

2.3 花粉特性对结实的影响

以‘22S131’为父本，‘22S146’和‘22S201’为母本，分别做杂交处理。采种调查后发现，花粉活性和萌发率与果实着果率和结籽量存在一定相关性。如表2 结合图1 所示，使用6:30 的花粉授粉，两对杂交组合着果率虽达到100%，但结籽量明显低于使用10:30的花粉授粉；7:30—10:30，花粉活性和花粉萌发率均大于90%，两对组合全部成功坐果，且结籽量无明显差异；11:30起，花粉活性和萌发率迅速降低，着果率受一定影响，结籽量也显著减少，随着授粉时间推迟，果实结籽量呈线性减少，至14:30 两对组合均无一坐果。综上所述，甜瓜的授粉效果可能与花粉的特性密切相关，萌发率高的花粉更容易使卵细胞受精发育，仅依靠花粉活力来预估授粉效果可能存在误差，花粉萌发率或许是更为准确的评价指标。

表2 不同授粉时间下甜瓜着果率与结籽量

2.4 贮存温度对花粉及授粉效果的影响

在相同的湿度和光照条件下比较不同温度处理雄花外植体对其花粉活性的影响。据观察，25 ℃和15 ℃处理的雄花均于4:00 左右开始散粉，且在散粉1 h 后达到饱和状态。5 ℃处理延迟了1 h，5:00 左右开始散粉，在散粉3 h 后达到满粉状态，但是由于低温导致了雄蕊萎蔫，花粉量明显少于其余两个处理。花粉特性测试结果（见图2）显示，15 ℃处理的雄花花粉活性、萌发率最高，分别为93.21%、94.64%，与自然开花条件下饱和状态无明显差异；其次是25 ℃处理，花粉活性、萌发率约为80%。5 ℃处理花粉活性、萌发率最低，散粉1 h 后分别为26.53%、21.69%，在满粉状态时略有提高。

图2 贮存温度对甜瓜花粉活性和萌发率的影响

2.5 贮存湿度对花粉及授粉效果的影响

在相同的温度和光照条件下比较不同湿度处理雄花外植体对其花粉活性的影响。据观察，80%湿度处理的雄花于4:00 左右开始散粉，1 h 后达到饱和状态。40%湿度和干燥处理的雄花同期散粉，但花粉分别在2 h 和3.5 h 后达到饱和状态。三种处理的花粉量无差异，低湿环境并未造成雄蕊损伤现象。花粉特性测试结果（见图3）显示，80%湿度处理的雄花花粉活性、萌发率分别为81.87%、78.44%，其次是40%湿度处理的雄花，满粉状态时分别达到75.35%、66.87%。干燥处理的雄花散粉1 h 后花粉活性、萌发率最低，分别为26.28%、9.98%，满粉状态时略有提高。80%湿度处理能提高散粉速度，使花粉尽快达到饱和状态，而干燥处理后的显著差异可能是由于雄蕊处于逆境环境而造成的反应。

图3 贮存湿度对甜瓜花粉活性和萌发率的影响

2.6 光照对花粉及授粉效果的影响

在相同的温度和湿度条件下比较不同光照时长处理雄花外植体对其花粉活性的影响。据观察，长光照处理的雄花于4:00 左右开始散粉，1 h 后达到饱和状态。长黑暗处理的雄花延迟4 h，在8:00 左右开始散粉，1 h 后达到饱和状态，两种处理的花粉量无差异。花粉特性测试结果（见图4）显示，长光照处理的雄花花粉活性、萌发率最高，分别为81.87%、78.44%，长黑暗处理散粉1 h 后萌发率最低。饱和状态时两种处理之间无明显差异，但是长光照处理能够促进提前散粉，增加授粉时长。两种处理的散粉时间差异显著，因此推测光照可能是促进雄蕊散粉的关键因素。

图4 光照处理对甜瓜花粉活性和萌发率的影响

2.7 不同处理对授粉效果的影响

不同处理的果实着果率和结籽量如表3 所示，其中5 ℃和0 湿度处理的着果率和结籽量明显低于其余处理，此结果与花粉活性和萌发率有相关性，低温低湿的逆境环境可能对花器官雄蕊造成一定损伤，导致花粉活性及萌发能力降低，从而降低雌雄配子的结合概率，最终影响了坐果的成功率和果实结籽量。其余处理均全部坐果，果实结籽量与花粉萌发率变化趋势相同，萌发率越高，其结籽量越多。根据结果统计，未开放雄花外植体置于15 ℃、80%湿度、长光照条件下贮存，不仅能保证花粉活性与萌发率与自然开放时无差异，而且能够极大限度提前散粉时间，增加授粉时长，提高育种效率。

表3 甜瓜雄花外植体不同贮存方式下着果率和结籽量

3 讨论与结论

在花器官的生长发育过程中，花粉的育性也随之变化，而育性与花粉特性息息相关。有研究表明，花粉活性和萌发率对于着果率和结籽率有着重要影响。陈源闽对茄子不同花龄的花粉进行探究，发现花粉活性越高，结籽率越高[6]；王少先等[7]和付超等[8]关于辣椒和白菜花粉的试验也证实了同样的结论。因此，花粉作为花器官中最为重要的物质，其活性对于育种工作有着重要的意义。自1982年利用TTC 染色法对小麦花粉活性测定以来，目前该方法已经应用在拟南芥、烟草等模式植物及大量蔬菜作物的花粉研究中[9]。本试验选择TTC 染色法对甜瓜花粉活性进行测定，在甜瓜育种方面有一定的辅助作用，然而我们在试验过程中发现染色测定的花粉活性与花粉萌发率有偏差，尤其是在雄花受到逆境胁迫后的散粉初期，对结籽量的差异规律进行分析，发现其与花粉萌发率有相关性，因此花粉萌发率有可能是鉴别杂交父本材料授粉效果的最佳指标，这一结果在其他作物的花粉特性分析中也有类似的验证[10-11]。对于不同的父本材料，其最佳离体培养时间与培养基类型均不同，因此需要根据试验情况而定。

花粉特性研究是顺利开展甜瓜人工辅助授粉的先前条件，而特性研究的前提是花粉的采集。在本研究中，我们测试了雄花自然开花条件下的花粉活性变化，发现花粉饱和时期，其活性最高可达94.9%，对雄花外植体离体散粉后的活性测试发现，最高可达93.32%，两者无明显差异。因此对于甜瓜，在开花前一天采集雄花贮存，待第二天散粉后进行授粉的方法可行，在杂交育种量大的情况下，该方法能够大大提高工作效率。此外，在授粉过程中，可以使用冰袋、湿布等工具包裹花粉容器，尽量模拟活性最高时的环境条件，以保持花粉活性，延长授粉时间。植物的花器官对外界环境存在一定的耐受范围，有研究显示，番茄、辣椒、黄瓜等植物在生殖生长阶段对外界环境十分敏感，在极高温和极低温环境胁迫下绒毡层降解，影响多糖代谢，从而导致花粉壁发育异常，最终表现为花粉失去活性[12]。在本试验中，我们探究甜瓜雄花外植体贮存的最佳温度、湿度、光照条件，结果显示不同环境下，其花粉活性和散粉时间均有差异。这一结果可能是由于环境胁迫导致花粉出现了内源物质或多糖代谢速度变化等生理生化活动，从而造成花粉发育和萌发的差异。本试验中，开花前一天的雄花外植体，置于温度15 ℃、湿度80%、长光照条件下，可以促进雄蕊提前散粉，加快散粉速度，且花粉饱和时活性达到最高。对于甜瓜而言，不同材料对环境的反应存在差异，花粉特性也与材料自身的遗传特性相关，因此需进一步探究。