基于PI3K/AKT信号通路探讨中医药干预糖尿病血管病变的研究进展

刘彦彤 王郁金 苏衍进 谭从娥 王相东 邢文文

糖尿病血管病变(diabetic angiopathies，DA)是糖尿病最常见且严重并发症之一。DA分为大血管病变和微血管病变，大血管以动脉内膜脂质沉着和平滑肌细胞增殖引起的内膜肥厚和狭窄为主要特征，主要表现为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS),微血管病变以微循环障碍、微血管瘤形成以及微血管基底膜增厚为主要特征，主要表现为糖尿病溃疡、糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病等。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinsoitide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT/PKB)信号通路作为胰岛素传导信号的主要介导途径之一[1]，其在细胞凋亡、增殖和血管异常的发病机制中起着重要作用[2]，并且可以提高胰岛素敏感性、糖脂代谢，保护血管内皮作用[3]。而中医药在治疗DA上有其优势与特色。因此，本文概述AKT通路及有关靶蛋白的介导机制与中医药基于此的干预及学术意义，以期为中医药干预DA并发症的临床与科研提供更多思路。

1 中医药通过PI3K/AKT调节血管内皮

1.1 AKT下游靶蛋白调节血管内皮细胞功能

血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)具有调节血管通透性、维持血流和调节血管平滑肌细胞增殖等重要功能。VEC的凋亡增加平滑肌细胞的增殖和迁移、血液凝固以及白细胞向内皮细胞的浸润，从而致内皮细胞功能障碍。在糖尿病状态下多种代谢紊乱加重内皮功能障碍，这也是糖尿病及其血管并发症发生的重要初始因素[3]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是内皮依赖性血管舒张的主要介质，具有舒张血管、抗凋亡、抗炎、抗血栓特性，对维持内皮舒张功能稳定起着决定性作用，能够进一步干预AS的发展[4]。VEC不直接分泌NO，而是由调控内皮源性NO产生的关键酶内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化衍生生成[5]。

1.2 中医药激活PI3K/AKT催化eNOS合成NO

eNOS是AKT的下游靶蛋白，激活的PI3K/AKT可以直接磷酸化eNOS，从而促进NO产生，改善血管内皮功能并且修复血管内皮。谢春燕[6]发现血管内皮细胞实验中高糖组浓度越高，NO分泌越少，使用大黄素干预后NO分泌明显增多，在进一步的研究机制中发现，大黄素提高AKT的磷酸化水平，促进NO分泌。一些研究中得出，柚皮苷、黄芪多糖也可以通过AKT通路，促进NO合成[7-9]。鲁雪丽[10]观察到参附注射液通过AKT通路促进NO产生的同时，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量显著降低，提示参附注射液通过AKT通路提高微循环灌注，减少氧化应激反应和心肌损伤。有研究表明，NO与活性氧(reactive oxygen species，ROS)相互限制活性，提高NO可减少ROS的产生，减少氧化应激损伤[11]。毛竹君等[12]观察到运脾散结活血方组NO水平升高，白介素-6(interleukin-6, IL-6)显著下降，提示激活AKT/eNOS通路减少炎症，改善血管内皮损伤。

VEC功能障碍不仅是AS的早期事件，而且贯穿着整个AS的进程。通过AKT通路干预NO的恢复，也意味着VEC的功能逐步恢复，这对减少血管损伤、减少炎症因子黏附，从而干预AS进程有着重要意义。最新研究表明，通过AKT/eNOS干预DA大血管病变仍然是研究重点，但趋向于与相关通路的交互反应，或通过miRNA下调目的基因的表达来更系统的研究AKT/eNOS对DA并发症的影响[13-14]。

1.3 中医药激活PI3K/AKT调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

激活AKT通路可促进血管内皮细胞增殖与毛细血管的生成[15]。而微血管是肉芽组织生长必不可少的因素，可给疮面提供重要的细胞因子，促进糖尿病溃疡(diabetic ulcer，DU)的愈合[16]。贾湘隆等[17]在实验中用回阳生肌膏外敷动物模型伤口时发现，实验组疮面早中期CD34、VEGF蛋白显著上升，而后期趋平于对照组，在AKT抑制组中CD34与VEGF则显著下降，提示激活的AKT有助于创面早期的修复。郭静等[18]观察到通赛脉片可以增加早期磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B，P-AKT)、eNOS、VEGF信号通路的表达，提示AKT通路的激活促进伤口愈合，其促进伤口愈合的机制可能集中在早期。VEGF是损伤后即刻伤口愈合的重要因素，并且可以加速非愈合性皮肤疮面的愈合。上调VEGF，可以促进血管生成的早期阶段即血管扩张、通透性、迁移和增殖。近年来，由于VEGF蛋白的重要性，大量研究通过AKT通路干预VEGF表达，或直接作用于VEGF，使之成为被治疗的靶蛋白来干预伤口的愈合、缺血性中风等，并为临床用药、研发新药提供指导[19-21]。

1.4 中医药抑制PI3K/AKT调控VEGF

人第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)是PI3K/AKT信号通路关键的负调控因子，能够抑制AKT的磷酸化。韩利平[22]、朱梦情等[23]发现黄地安消组大鼠p-AKT、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α)、VEGF水平明显下降，假性激酶蛋白3(tribbles homolog 3/pseudokinase 3，TRIB3，TRB3)、PTEN蛋白水平显著上升，提示抑制AKT可降低HIF-1α和VEGF的表达，其进一步机制为TRIB3、PTEN抑制AKT通路，阻断PKB和酶活性的下游来调节内皮细胞VEGF信号通路和细胞反应，从而干预AS的进程。杨春宁等[24]通过三七总皂苷抑制CD34、VEGF、PI3K、AKT蛋白表达下降，抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和内膜增生。高泓[25]使用参芪复方组抑制PI3K/AKT/eNOS表达，降低VEGF表达，抑制内皮细胞凋亡阻止动脉粥样斑块形成和病理性新生血管形成。有研究表明调节VEGF靶蛋白可干预AS的进程[26]。上述研究中，中医药通过抑制PI3K/AKT通路调节DA大血管病变减少VEGF表达来干预AS，与研究[6-10, 12]激活AKT磷酸化eNOS恢复VEC功能阻止AS进程机制不同，但是VEGF的产生是血管内高糖、缺氧环境的反应，抑制AKT则会加重血管内糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)的蓄积，形成恶性循环，而通过减少糖尿病血管内AGEs，改善炎症才是解决问题根本答案。因其两者所作用的靶蛋白不同，何种对糖尿病大血管病变更有临床意义则需要进一步的研究。

杨敏[27]在实验中观察到右归丸组VEGF、血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2)表达受到抑制，并减少二者结合，可进一步抑制PI3K、AKT的表达，达到抑制视网膜内皮细胞的增殖及迁移和内膜增生，致高糖缺氧下视网膜病理性新生血管生成减少。与研究通过上调VEGF不同，以临床干预目的不同而进行调整，即DU则以激活为主，促进伤口愈合，而糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)则以抑制AKT减少VEGF表达产生病理性新生血管为主[17-18]。目前，国内外研究表明，VEGF与糖尿病视网膜病变的发病机制密切相关，通过中医药活性成分或miRNA调节不同病理改变的DR期间VEGF的表达，对控制DR的发展起着至关重要的作用[28-29]。

2 中医药通过PI3K/AKT调节代谢

2.1 AKT下游靶蛋白促进代谢，减少AGEs蓄积、氧化应激与炎症

在持续高糖内环境下，AGEs增多，致使超氧化物增多，PI3K/AKT信号传导受阻，eNOS活性下降，NO合成减少，血管始终处于慢性炎症并形成恶性循环。而磷酸化的AKT可刺激葡萄糖转运蛋白-4(glucose transporter-4，GLUT-4)的表达和易位，增加糖原合成，促进糖酵解，抑制糖异生，及抑制β细胞凋亡，增加β细胞增殖与生存，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗状态[30-31]。并且，磷酸化的AKT通过抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)来降低糖原合酶的磷酸化并抑制关键糖异生酶-磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)的表达，最终促进糖原合成[32]。

2.2 中医药激活PI3K/AKT调节代谢

王景尚[33]在西洋参茎叶总皂苷组中发现p-AKT、p-GSK-3β(磷酸化GSK-3β)蛋白表达显著增加，而肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血清可溶性细胞间粘附分子-1(serum soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1)、血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(hemagglutinin like oxidized low density lipoprotein receptor 1，LOX-1)、AGEs含量显著降低，在进一步的研究机制中发现，激活AKT/GSK-3β能调节代谢，减少AGEs，LOX-1的过表达及血管炎症反应，从而干预血管内皮损伤。目前，有研究发现GSK-3β靶蛋白不仅参与糖代谢、炎症，还参与细胞凋亡和氧化应激[34-35]。郭杨志等[36]观察到白虎汤组PI3K、AKT蛋白、肝脂肪酸氧化基因mRNA升高，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)表达降低，提示白虎汤可通过改善糖脂代谢，减少炎症因子，间接改善血管炎症损伤。上述研究中相关炎症因子指标有所下降，其原因为AKT通路激活缓解血管内代谢紊乱，改善内环境，减少炎症因子表达的条件。姚灿坤等[37]在研究中发现PI3K、AKT、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)明显升高，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、IL-6、MDA显著降低，提示冠心通络方组激活AKT通路降糖、减少氧化应激损伤和炎症反应。靳立英[38]在实验中观察到AGEs浓度越高，细胞活力越差，使用红芪多糖后ROS、MDA含量明显降低，SOD、PI3K含量明显升高，提示红芪多糖组通过AKT通路减少血管内氧化应激所致血管损伤。高糖环境下加重氧化应激反应，过量的ROS又会促进AGEs的积累，AGEs则又加剧DA并发症的发展。有研究[39]观察到AKT通路具有升高抗氧化酶的作用。这与目前DA并发症与氧化应激损伤干预学说[40]方向一致，即抗氧化剂难以达到理想效果，通过干扰活性氧产生酶或提高抗氧化酶的含量来达到平衡，这种上调抗氧化防御系统，可能是糖尿病并发症更具有前景的治疗选择。

3 中医药通过PI3K/AKT调节炎症反应

3.1 抑制AKT可减轻血管内炎症反应

核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路是炎症反应主要介质，它可以调节多种炎症细胞因子的表达，并且还是参与氧化应激表达的重要因子[41]。抑制NF-κB可以减轻TNF-α等诱导的内皮细胞炎症[42]。抑制AKT活性可抑制NF-κB启动子活性[43]。

3.2 中医药抑制PI3K/AKT调节炎症反应

朱昌国等[44]发现小檗碱降低PI3K、AKT表达，上调P21表达，进一步研究其机制为抑制AKT、抑制促炎介质水平，上调P21抑制细胞增殖，干预AS的发展进程。抑制细胞增殖和减少长期炎症并发症的发生可能是治疗糖尿病血管并发症的重要方法。但与AKT调节代谢间接改善炎症不同，其作用机制为抑制AKT活性。此两者观点不同，需要进一步研究。但是，最新研究表明，NF-κB在AS中起着重要作用，通过AKT通路靶向NF-κB或者直接靶向NF-κB依然是研究重点，并且有望成为DA大血管病变治疗的潜在生物标志物和治疗靶点[45-46]。

4 中医药通过PI3K/AKT调节细胞凋亡

4.1 激活AKT调节细胞凋亡

PI3K/AKT途径在调节细胞存活中起着关键作用，通过磷酸化AKT下游多种蛋白调节细胞存活[47]。B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl2-Associated X基因(BCL2-Associated X，Bax)是对立拮抗的调控基因，Bcl-2抑制凋亡，Bax发挥凋亡作用，而半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白酶，其激活受到一系列信号转导级联的调控[48]。磷酸化的AKT调节Bcl家族和Caspase家族抑制细胞凋亡[49]。

4.2 中医药激活PI3K/AKT调节细胞凋亡

刘阳等[50]发现银杏叶提取物组降低凋亡蛋白Caspase 3、Bax表达,调升抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制由IL-1β所诱导的内皮细胞凋亡，这与IL-1β刺激组结果相反，提示银杏提取物能通过AKT通路保护细胞凋亡。吴洋[51]在AKT抑制组中发现，人参皂苷Rb1诱导LDH和CK的下降明显被抑制，并且抑制了Bc1-2升高和降低Caspase-3的表达，验证了人参皂苷Rb1的护心作用与AKT通路的激活有关，其进一步机制为NO分泌增多，改善微循环，减少心肌损伤灶，升高抗凋亡蛋白Bc1-2，降低促凋亡蛋白Caspase-3，减少心肌细胞凋亡。武单单等[52]观察到丹皮酚组上调抗凋亡蛋白AKT、Bcl-2、Bcl-xl的表达，抑制促凋亡蛋白细胞外信号调节激酶1和2(extracellular signal regulated kinases 1 and 2，Erk1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1和2(Phosphorylated Erk1/2，p-Erk1/2)、Bax、裂解半胱天冬酶3(cleaved-Caspase3)、细胞色素C(cytochrome c，Cytc)的表达，与吴洋发现相符，提示增加AKT表达可抑制心肌细胞凋亡。心肌细胞是一种高度分化的终末细胞，一般不能增殖，因此避免心肌细胞的凋亡或者损伤，显得非常重要，尤其是糖尿病患者。目前，有大量研究[53-54]以AKT通路的抗凋亡为线索，旨在寻找合适的新药或更好的干预相关靶蛋白的方法，来减缓不可再生的心肌细胞凋亡。

王皎皎等[55]研究表明人参皂苷Rg3组降低Bad、Caspase-3、升高Bcl-2，使凋亡细胞比例降低，并降低VEGF、ICAM-1蛋白表达，改善视网膜组织损伤。使用AKT抑制剂后，指标呈相反增长，提示人参皂苷Rg3通过激活AKT通路抑制细胞凋亡。田丽珍等[56]发现大黄蛰虫丸组PI3K、AKT含量升高,凋亡蛋白Caspase-9含量降低，提示大黄蛰虫丸抑制AKT减少视网膜周细胞凋亡。周细胞的缺失可显著促进VEGF信号传导，而VEGF对细胞凋亡又有明显的影响。因此，周细胞的凋亡被认为是DR的早期病变。目前，AKT通路中多种下游靶蛋白直接或间接参与调节周细胞的存活或驱动微血管的VEGF细胞因子信号，并且已被证明能有效预防疾病的进程和视力改善[57-58]。

5 讨论

AKT通路发现至今30余年来的研究揭示了一个复杂的分子机制调节和功能的蓝图。但是，目前中医药基于AKT通路干预DA的研究主要仍然以相关性为主体，或相关靶蛋白与DA某个并发症的研究，缺乏深入性的研究。而AKT通路的介导是一系列靶蛋白的级联反应，并且与其他有关信号通路的交互反应。但现有研究仍然会给科研者不少启示。首先，贾湘隆等[17]通过局部用药外敷上调VEGF表达，在最小程度或不影响其他DA并发症的前提下，改善局部疮面愈合。这种局部用药或许为一些DA并发症的干预提供了更多可能。其次，吴洋[51]在实验中AKT抑制剂的使用，才明确了人参皂苷Rb1的护心作用是基于AKT通路，而非其本身。而大多数中医药关于AKT干预DA中所纳入AKT抑制剂的研究较少，只是研究者选取疾病与之关联性靶蛋白，对中医药是否基于AKT通路及其机制的研究却是未能较为清晰的阐述。再次，DA并发症发病因素本身就是糖脂代谢紊乱，AKT通路介导障碍所致的胰岛素抵抗加剧，本文综述不少研究通过抑制整个AKT通路来调控下游靶蛋白减缓AS进程，而非直接作用于靶蛋白，尽管实验中证明减缓AS进程有效，但未能验证是否长期可行。目前，现代医学通过基因手段调节靶蛋白，而中医药也有不少关于中医药活性成分或通过其天然骨架的衍生物直接作用于AKT通路下游靶蛋白的研究[59]，具有多靶点和双向调节作用的优点，并且其具有重要的学术价值。

综上，Akt通路参与血管生理和病理的发生和发展。Akt通路的药物靶向性在治疗DA及其并发症方面具有潜在的应用价值。但对我们来说，探索Akt通路的使用是值得的。因此，国内外学者充分发挥中医药优势，筛选有效的药材和复方，这对中医药干预DA具有重要的学术价值。并且，DA诸多并发症的发病机制复杂，需要从多个角度进行广泛深入的研究，以丰富中医药干预DA的作用，并指导进一步的转化研究和临床试验。本文尚且存在不足之处，因纳入文献有限，未能涵盖AKT信号通路中一些其他关键靶蛋白，与其他关键DA并发症，望后续能完整其综述。