响应面优化伏毛铁棒锤总生物碱微波辅助提取工艺

多杰措 ，李彩霞 ，许显莉 ，宋文珠 ，马世震 *

（1.中国科学院 西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，青海 西宁 810008；3.中国科学院大学，北京 100049）

伏毛铁棒锤（Aconitum flavumHand.-Mazz.）属于毛茛科乌头属植物，别名为断肠草、乌药和一支蒿等［1］，是我国传统民族药材也是甘、宁、藏等地广泛应用的民间草药，主要分布于内蒙古南部、青海、甘肃、宁夏南部、四川西北部、西藏北部等地，生于海拔2 000～4 600 m的林下、灌丛和高山草甸［2］。以块根和幼苗入药，其干燥块根俗称“铁棒锤”［3］。块根具有活血祛瘀、祛风湿、止痛、消毒的功效；主要用于风湿性关节炎、关节痛、毒热、肿瘤等疾病的治疗［4-5］。现代药理毒理研究表明，生物碱类是伏毛铁棒锤的主要活性成分，具有镇痛、局麻、解热、抗炎、抗肿瘤等药理作用［6］。

目前，伏毛铁棒锤总生物碱的提取方法主要有回流法［7］、浸提法［8］、超声波辅助提取法［9］等。微波辅助提取法提取效率高、能耗低、安全环保，而有关研究较少［10-11］。因此，本试验采用微波辅助法提取伏毛铁棒锤总生物碱，并采用单因素试验和Box-Behnken试验设计响应面法对其提取工艺参数进行优化，然后进行最优工艺验证性试验，并测定不同地区伏毛铁棒锤总生物碱含量，以期为该药材开发利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

FW100高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；ML204T 型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；XH-300B微波超声波组合催化合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；Heizbad HB digit旋转蒸发仪（博劢行仪器有限公司）；Agilent Infinity 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；JADE-PAK ODS色谱柱（广州太玮生物科技有限公司）。

1.2 试验试剂与材料

乌头碱对照品，批号DSTDW000602，质量分数≥98%；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；乙腈（色谱纯，德国默克股份两合公司）；甲醇（色谱纯，德国默克股份两合公司）；磷酸（色谱纯，德国默克股份两合公司）。试验材料见下表1。

表1 伏毛铁棒锤样品来源Tab.1 Origin of A.flavum

2 试验方法

2.1 乌头碱标准品溶液的制备

精密称取0.001 0 g的乌头碱标准品用甲醇超声溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，制成0.1 μg/μL的乌头碱标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精确称取伏毛铁棒锤根的干燥粉末1.00 g，粉末过60目筛，置于25 mL具塞试管中，在选定的微波时间、温度、料液比以及甲醇体积分数下提取，共三次，抽滤得提取液并定容至25 mL的容量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，得供试品溶液。采用高效液相色谱法对提取液进行测定，计算粗提物中总生物碱含量。

2.3 色谱条件

色谱柱为 JADE-PAK ODS（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱（表2），检测波长235 nm，检测时间为35 min，柱温25℃，进样量10 μL，体积流量1.0 mL/min，乌头碱对照品色谱图见图1-A，伏毛铁棒锤样品色谱图见图1-B。

表2 梯度洗脱的流动相比例Tab.2 The mobile phase ratio of gradient elution

图1 乌头碱标准品（A）和样品（B）色谱图Fig.1 Chromatogram of reference standards （A） and test samples （B） of aconitine

2.4 线性关系

吸取2.1项下配置的乌头碱标准品溶液，过0.22 μm微孔滤膜滤过，依次设定进样量为 2、4、6、8、10、12、14、16 μL，按2.3项下的色谱条件进行测定分析。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品质量（X）为横坐标，进行线性回归。

2.5 单因素试验

2.5.1 温度对提取率的影响

称取1.00 g伏毛铁棒锤粉末，固定料液比为1：10（g/mL），甲醇体积分数为100%，提取时间为8 min，分别在20、30、40、50、60℃的温度下提取，考察不同温度对总生物碱提取率的影响。

2.5.2 料液比对提取率的影响

称取1.00 g伏毛铁棒锤粉末，固定温度为50℃，微波时间为8 min，甲醇体积分数为100%，分别在1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）的料液比下提取，考察不同料液比对总生物碱提取率的影响。

2.5.3 时间对提取率的影响

称取1.00 g伏毛铁棒锤粉末，固定料液比为1：20（g/mL），温度为50℃，甲醇体积分数为100%，分别在4、8、12、16、20 min的时间下提取，考察不同提取时间对总生物碱提取率的影响。

2.5.4 体积分数对提取率的影响

称取1.00 g伏毛铁棒锤粉末，固定提取时间为16 min，温度为50℃，料液比为1∶20（g/mL），分别在20%、40%、60%、80%、100%的甲醇体积分数下提取，考察不同体积分数对总生物碱提取率的影响。

2.6 响应面试验

根据单因素试验结果，选取对伏毛铁棒锤总生物碱提取率影响较大的因素作为响应面Box-Behnken设计的变量，运用Design expert 12.0软件的响应面法并以总生物碱提取率为指标安排试验。

2.7 最佳萃取工艺的确定及验证试验

将Design expert 12.0软件分析预测得到的最佳提取工艺参数进行调整：温度48℃，料液比1∶19（g/mL），时间12 min，甲醇体积分数39%。取3份1.00 g的伏毛铁棒锤粉末，按最佳萃取工艺进行三次提取试验并计算得率。

2.8 伏毛铁棒锤中总生物碱含量测定

以乌头碱的量代表伏毛铁棒锤中总生物碱含量，根据响应面试验得到的最优工艺测定分析不同地区伏毛铁棒锤中总生物碱的含量。

2.9 数据统计分析

用IBM SPSS Statistics 25和Design-Expert 12.0软件进行数据处理与分析。

3 结果与分析

3.1 线性关系考察结果

按照“2.3”项色谱条件依次进样。以峰面积（Y）为纵坐标、乌头碱质量（X）为横坐标进行线性回归分析，得乌头碱回归方程为Y= 1 021X+ 21.129，R2= 0.999 5，表明乌头碱在选定的峰面积和相对质量范围内具有良好线性关系。

3.2 单因素试验结果

由图2A可知，随着温度的升高，总生物碱得率先升高后降低，当温度高于50℃，总生物碱提取得率开始下降，可能是因为过高的温度导致部分生物碱被分解或转化［12］。因此，选择50℃为最适提取温度。

由图2B可知，伏毛铁棒锤总生物碱的提取得率随着料液比的增加呈现先升高后降低趋势，并在料液比为1∶20（g/mL）时，达到最高值，与刘树兴等［13］的研究结果一致。料液比的增加使溶液传质推动力变强，使溶剂进入细胞壁的速度加快，从而释放胞内物质，继续增大料液比，细胞转运通道达到饱和［14］。因此，选择1∶20（g/mL）为最适料液比。

由图2C可知，微波提取时间在4～12 min范围内，总生物碱得率呈平稳上升趋势，当提取时间为16 min时，得率最高；时间高于16 min，总生物碱提取得率降低，时间过短提取不充分，过长导致生物碱降解［15］。因此，选择16 min为最适提取时间。

由图2D可知，当甲醇体积分数为40%时，得率达到最高值；随着体积分数的增加其得率逐渐降低。推测由于甲醇浓度的增加使伏毛铁棒锤中的脂溶性成分、醇溶性杂质溶出，其中脂溶性成分可能与甲醇-水分子结合，从而与伏毛铁棒锤中的生物碱形成竞争关系，导致伏毛铁棒锤总生物碱的得率降低［14］。

图2 不同因素对总生物碱得率的影响Fig.2 Effects of different factors on the yield of total alkaloids

3.3 响应面试验结果

3.3.1 Box-Behnken 试验设计

采用Box-Behnken中心组合试验设计原理，通过分析单因素试验结果，研究各因素对总生物碱提取效果的影响，使用Design Expert 12.0进行响应面设计，以温度（A）、料液比（B）、时间（C）、甲醇体积分数（D）为自变量，总生物碱提取得率为评价指标，进行四因素三水平的响应面试验，预测伏毛铁棒锤总生物碱的最佳提取工艺，具体的因素水平设计见表3。响应面实验结果见表4。

表3 响应面试验因素与水平Tab.3 Response surface test factors and levels

3.3.2 模型建立与方差分析

将表4所得数据用Design-Expert 12.0进行响应面试验分析，以总生物碱提取率为响应值，对各因素进行回归分析，得到二次多元回归方程：

表4 Box-Behnken设计-响应面设计试验因素水平及试验结果Tab.4 Box-Behnken design-response surface design test factor levels and test results

续表

Y= 0.288 6 - 0.003 8A- 0.003 7B- 0.003 1C+0.000 8D+ 0.005 3AB-0.000 7AC- 0.008 3BD+0.002 5CD- 0.014 4A2- 0.013 7B2+ 0.000 5C2-0.01 7 3D2。

由表5方差分析结果可知，二次回归模型影响极显著（P＜ 0.01），失拟项为0.070 8（P＞ 0.05），表明回归模型与实测值拟合度较好，不存在明显失拟因素；R2= 0.919 2，CV= 2.07%＜ 5%，表明该模型重复性好；另外，A、B项的P＜ 0.05，说明温度和料液比对伏毛铁棒锤总生物碱得率有显著影响。由表5中一次项、二次项及交互项P值可知，AD、BD交互作用显著（P＜0.05），A2、B2、D2均达到极显著水平（P＜ 0.01）。由F值可知，四个因素对总生物碱含量影响程度依次为A＞B＞C＞D，即温度＞料液比＞时间＞甲醇体积分数。

表5 响应面二次模型的方差分析结果Tab.5 ANOVA results for the response surface quadratic model

3.3.3 响应面分析

为进一步确定A、B、C、D四个因素的最佳水平范围以及因素之间的交互作用对伏毛铁棒锤总生物碱提取得率的影响，根据分析结果做三维曲面图（图3）。曲面图中等高线的形状、密集程度和响应曲面的陡峭程度可以判断因素之间的交互作用。等高线密集且呈椭圆形，响应曲面的坡度越陡峭，表明试验因素对响应值影响越大，两因素间的交互作用越显著。反之，等高线稀疏呈圆形，响应面坡度越缓表明两组因素交互作用不显著［16］。由图3可知，料液比（B）的响应曲面坡度最陡峭，时间（C）的坡度最缓，表明料液比对总生物碱得率影响最大，而时间对得率的影响最小。温度（A）和体积分数（D）、料液比（B）和体积分数（D）的等高线密集呈椭圆形且响应面坡度陡峭，表明AD、BD交互作用影响显著，其他因素交互作用影响较小，与方差分析结果一致。通过Design expert 12.0中的Numerical分析预测得到的最佳提取工艺参数为：温度48.372℃，料液比1∶19.080（g/mL），时间12 min，甲醇体积分数为38.828%，在此条件下，伏毛铁棒锤总生物碱提取得率为0.293%。

图3 各因素交互作用的响应面图Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors

3.3.4 验证试验

在最佳提取工艺条件下进行验证试验，总生物碱得率平均值为0.288%（RSD为1.120%）与预测值（0.293%）接近，表明调整后的总生物碱微波辅助提取工艺与响应面优化结果一致，该工艺稳定可靠。

3.4 不同地区伏毛铁棒锤中乌头碱的含量测定

在最佳提取工艺条件下测定了不同地区伏毛铁棒锤中乌头碱的含量，其中青海贵南乌头碱含量最高，青海甘德乌头碱含量最低，测定结果见表6。

表6 不同地区伏毛铁棒锤中总生物碱含量Tab.6 Content of total alkaloids in A.flavum from different regions

4 讨论与结论

马新换等［17］用加热回流法测得伏毛铁棒锤中总生物碱含量为0.234%；林丽等［18］用浸提法测得不同产地铁棒锤中总生物碱含量为0.036%～0.201%，本研究采用微波辅助提取法测得不同地区伏毛铁棒锤总生物碱含量为0.090%～0.290%，得率相对较高。回流法、浸提法耗时耗能且得率较低，而微波辅助提取是利用不同组分吸收微波能力的差异，在细胞内部产生热应力，热运动加剧，使细胞壁破裂，溶剂易于进入细胞内，溶解并释放胞内产物［19］；具有溶剂用量少、快速高效的特点。因此，该方法提取伏毛铁棒锤总生物碱的提取效率较高。

生物碱是一种能对多种环境胁迫作出反应的次生代谢产物，生物碱含量提高能增强植物对环境的适应性。本研究对不同产地伏毛铁棒锤总生物碱进行了含量测定，其中贵南、阿坝样品中生物碱含量显著高于其它产地。可能是因为贵南县草原滩地较多，土壤均为壤土且呈微碱性或碱性，有机质丰富；阿坝牧草地、草甸土资源丰富适合伏毛铁棒锤生长发育。王容［9］、林丽［18］、赵梅宇［20］等人测定了不同地区铁棒锤总生物碱含量，分别以宁夏隆德、陕西秦岭、西藏的含量最高，分别为0.365%、0.201%、0.117%。药用植物的生长发育、有效物质的合成与积累，一方面取决于遗传特性，另一方面与其生长环境条件相关［21］。不同产地的伏毛铁棒锤样品总生物碱含量存在较大差异，可能是因为产地不同导致气候、土壤、温度、辐射、水分等环境因子不同［22］，同时也受药材采集的生长年限和采集月份的影响。

本研究用微波辅助提取伏毛铁棒锤总生物碱，经单因素试验、响应面优化得到最佳工艺为温度48℃，料液比1∶19（g/mL），时间12 min，甲醇体积分数39%。说明该工艺稳定可靠、高效便捷。综上所述，本研究能够为伏毛铁棒锤资源的开发利用提供参考依据。