血清zonulin、GPC3与妊娠期肝内胆汁淤积症患者不良妊娠结局的关系*

杨 姗，穆兰芳，陈玉芬，范晓红，王淑花

青海省妇女儿童医院妇产科，青海西宁 810000

妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)是一种多发生于妊娠中晚期的并发症[1]，临床表现为皮肤瘙痒、胆汁酸水平升高并可伴有黄疸。由于胆汁淤积肝内，造成肝功能下降，凝血因子合成减少，导致产后出血的风险增加，可引起胎儿窘迫、早产甚至胎死宫内[2]。目前对于ICP的病因及发病机制尚未完全清楚，研究表明其可能与遗传、免疫及环境因素有关[3]。血清连蛋白(zonulin)是一种调节蛋白，通过调节细胞间紧密连接来增加肠道通透性，是已知的唯一控制肠道通透性的生理蛋白，是肠道渗漏的标志物[4]。在妊娠期间及妊娠后期，ICP患者的肠道通透性增加，细菌内毒素及参与肠肝循环的胆道代谢产物可通过肠道渗漏途径参与到ICP的发生发展中[5]。同时，作为ICP发病重要一环，胆汁酸的代谢受肠道菌群代谢的影响，肠道菌群的代谢可以显著影响胆汁酸信号传导[6]，zonulin也被认为参与到肠道微生态的调节中[7]。因此，zonulin可能与ICP的发病密切相关。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是近年来新发现的一种肝细胞癌血清标志物，在肝细胞癌中特异性高表达[8]，不仅如此，其在胆道闭锁患儿肝组织中表达升高，与肝功能异常及纤维化程度呈正相关[9]。当前研究表明zonulin、GPC3可能对ICP的疾病发生发展存在一定的预示作用，本文以此为出发点，探索二者联合检测对ICP患者不良妊娠结局的预测价值，为ICP的临床诊治提供一定的参考,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2019年1月至2021年5月妇产科就诊的150 例 ICP 患者作为观察组，并选取同期孕周相当(21～34周)的正常妊娠中晚期孕妇150例为对照组。纳入标准：(1)年龄 20～40岁，自然受孕且单胎妊娠；(2)处于妊娠中晚期；(3)按照《妊娠期肝内胆汁淤积症诊疗指南(2015 )》[1]诊断标准，临床确诊为ICP；(4)本次ICP的发病为初发；(5)未服用影响肝功能及胆汁酸分泌的药物或保健品；(6)临床资料完整且愿意参与并配合本研究。排除标准：(1)存在严重心、肾等脏器疾病；(2)存在引起皮肤瘙痒的非胆汁淤积性疾病；(3)合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血压等妊娠期并发症；(4)因疾病或其他原因导致无法配合本次研究者。

目前对于ICP的分度主要参照文献[1],轻度：(1)血清总胆汁酸≥10～40 μmol/L；(2)临床症状以皮肤瘙痒为主，无明显其他症状。重度：(1)血清总胆汁酸≥40 μmol/L；(2)临床症状为瘙痒严重；(3)伴有其他情况，如复发性ICP、曾因ICP致围产儿死亡者；(4)早发型ICP。

按照上述的分度标准将观察组分为轻度组108例和重度组42例。收集对照组、轻度组、重度组孕妇的一般临床资料，3组年龄、分娩孕周、分娩次数、流产次数、体重指数(BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有临床可比性，见表1。所有患者及家属均对本研究知情同意并签署相关知情同意书。本研究获得本院伦理委员会的批准。

表1 3组孕妇的一般临床资料

1.2方法 制定临床信息收集表，收集上述所有孕妇的临床资料，包括年龄、分娩孕周、分娩次数、流产次数、BMI、妊娠结局等，观察组于入院第2天清晨空腹检查血清胆汁酸水平、肝胆功能、血常规、血脂、凝血功能等实验室指标，对照组来本院产检前空腹。观察组及对照组血清zonulin及GPC3检测方法：抽取所有孕妇空腹静脉血2～5 mL，离心后取上层保存于-80 ℃冰箱，待所有孕妇血清收集完毕后进行统一检测，检测采用酶联免疫法，试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，严格按照操作说明书进行，对所有待测样本设置3个副孔，结果取均值。

1.3治疗方法 按照文献[1]的标准，熊去氧胆酸是目前ICP治疗的一线药物。按照15 mg/(kg·d)的剂量分3～4次口服，常规剂量效果不佳未出现明显不良反应时，可加大剂量为1.5～2.0 g/d。总体治疗目标为缓解瘙痒症状，降低血胆汁酸水平，改善肝功能，延长孕周，改善妊娠结局。

1.4不良妊娠结局的判定 不良妊娠结局包括自然流产、早产、过期死、死胎及死产、低出生体重儿、巨大儿、新生儿窒息、出生缺陷、胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫、产后出血等，出生缺陷病种参照国际标准(ICD-10编号740～759)进行分类，诊断标准参照《妇产科学》(乐杰主编第7版)及《儿科学》(王卫平主编第8版)，妊娠结局中有任一种异常即为不良妊娠结局。

2 结 果

2.13组孕妇的血清zonulin及GPC3水平比较 对照组血清zonulin、GPC3水平均显著低于轻度组及重度组，差异有统计学意义(P<0.05)；轻度组血清zonulin、GPC3水平显著低于重度组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清zonulin、GPC3水平比较

2.2观察组与对照组不良妊娠结局发生情况比较 观察组的150例ICP患者中40例妊娠结局为不良妊娠，总发生率为26.67%，产后出血、胎儿宫内窘迫、胎儿生长受限、早产、胎儿死亡分别占8.00%、6.67%、 4.67%、6.00%及1.33%；对照组150例孕妇中9例妊娠结局为不良妊娠，总发生率为6.00%，产后出血、胎儿宫内窘迫、胎儿生长受限、早产分别占2.00%、0.67%、1.33%及2.00%。观察组不良妊娠结局的总发生率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 观察组及对照组不良妊娠结局发生率比较[n(%)]

2.3不良妊娠结局的危险因素分析

2.3.1单因素分析 为进一步探索孕妇发生ICP的危险因素，根据观察组150例患者是否发生的不良妊娠，分为发生不良妊娠结局组(简称不良妊娠组，41例)及未发生不良妊娠结局组(简称正常妊娠组，109例)。统计上述两组孕妇的一般资料(年龄、分娩孕周、分娩次数、流产次数及BMI)、血清血脂指标(胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)、肝胆功能相关指标(总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、血清总胆汁酸、甘胆酸、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶)、凝血功能(凝血酶原时间、凝血酶时间、部分活化凝血活酶时间、纤维蛋白原)及血清zonulin、GPC3水平。在ICP患者中，年龄、总胆红素、直接胆红素、总胆汁酸、甘胆酸、部分活化凝血活酶时间、纤维蛋白原水平、血清zonulin水平、血清GPC3水平与ICP患者发生不良妊娠结局密切相关(P<0.05)。见表4。

2.3.2多因素分析 建立非条件Logistic回归模型，以孕妇发生ICP为应变量，赋值1=发生，0=否。以单因素分析(表4)中P<0.10的指标/因素为自变量。为提高统计效率，并同步于后续的回归预测模型，将连续数值的自变量，均参考两组总均值进行分段，转化成两分类变量。采用逐步后退法，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。年龄、直接胆红素、总胆汁酸、纤维蛋白原、血清zonulin、血清GPC3水平均为ICP患者发生不良妊娠结局的危险因素(P<0.05)。见表5。

表4 ICP患者不良妊娠结局的单因素分析

表5 ICP患者不良妊娠结局的多因素分析

2.4血清zonulin及GPC3对ICP患者不良妊娠结局的预测价值 进一步探讨血清zonulin及GPC3对ICP患者不良妊娠结局的预测价值：以不良妊娠组(n=41)为阳性样本，以正常妊娠组(n=109)为阴性样本，建立ROC曲线诊断分析模型并计算曲线下面积(AUC)，以及按实测样本计算灵敏度、特异度、准确度。两个指标单独及联合应用时，ROC的AUC(95%CI)分别为0.742(0.557～0.927)、0.721(0.464～0.967)、0.855(0.729～0.979)，诊断效能较高，其中两个指标的联合应用更高。见表6。ROC曲线分析见图1。联合应用为Log(P/1-P)模式，即建立回归预测模型，将各单独应用指标的回归系数β作为计分参数，归一化加权计算并对应处理各样本资料，计算各ROC参数并制作ROC曲线。

表6 血清zonulin及GPC3对ICP患者不良妊娠结局的预测价值

图1 zonulin及GPC3对不良妊娠结局的预测ROC曲线

3 讨 论

ICP是妊娠中晚期常见且严重的并发症之一，虽然发病在母体但对胎儿危害更大，易引起早产、胎儿宫内窘迫、甚至死胎、死产[2]。由于目前发病机制尚不明确，临床上用于预测ICP不良妊娠结局的手段不足，探索具有预测诊断ICP患者不良妊娠结局的有效生物标志物成为临床研究之热点。

zonulin是可逆调节肠道通透性的人类蛋白质，其所调控的肠道渗漏是肠道多种细菌内毒素、胆道代谢产物进入血液循环的重要途径之一，REYES 等[5]研究指出肠道渗漏可能与ICP的发生发展密切相关。GPC3是一种近年来发现的与原发性肝癌关系较为密切的标志蛋白，其对肝功能的评估也具有一定的价值，于肝细胞损伤的早期即出现升高。GPC3突变可激活Wnt/Frizzled/β-catenin和FGF/PI3K/AKT信号通路，导致细胞的增殖和凋亡失衡，是肝细胞癌(HCC)发生的重要原因之一。同时，GPC3可以与Yes相关蛋白(YAP)相互作用，参与到Hippo通路的调控中，介导HCC的形成。GPC3还可与多种细胞因子，非编码RNA相互结合，调控HCC的发生发展[10]。在胆道闭锁性疾病中，GPC3的表达与α-SMA的表达呈明显的正相关，与肝功能异常及肝纤维化的发生具有密切联系[11]，其与α-SMA具体机制仍有待进一步阐明。ICP患者肝功能异常，故GPC3可能也参与到ICP的疾病进展中。

本研究结果显示，对照组血清zonulin、GPC3水平均显著低于轻度组及重度组，差异有统计学意义(P<0.05)；轻度组血清zonulin、GPC3水平显著低于重度组，差异有统计学意义(P<0.05)。zonulin作为调节肠道上皮与上皮之间紧密连接的活性蛋白，其在肠道的消化、吸收功能中必然扮演者重要的作用[4]。zonulin在ICP患者中明显升高可能与以下两个原因相关：从肠道渗漏的角度而言，肠道的通透性增加可导致各种细菌内毒素进入血液循环，zonulin则是介导“通道”的关键，因此，zonulin表达水平的高低可能与ICP患者的病因来源密切相关，zonulin表达水平越高，细菌内毒素则更多地进入血液循环，ICP越为严重[12]。从肠循环的角度而言，胆汁酸对肠道中脂肪吸收具有重要的意义[13]，由于zonulin表达水平异常，造成肠道黏膜的吸收功能障碍，继发性引起肠肝循环及胆汁酸的异常，并最终导致患者出现明显的肝功能障碍，这可能是ICP患者中血清总胆汁酸明显升高的原因之一。

GPC3是一种肿瘤标记物，其在多种肝细胞损伤性疾病的早期即明显升高，是预示肝细胞损伤的良好指标，其表达程度越高提示肝细胞损伤愈为严重[9]。因此，GPC3的表达程度越高，ICP患者的病情也越为严重。由于胆汁淤积，造成母体肝功能及肠道吸收功能的异常，出现胆红素代谢及凝血异常的同时可存在有胎儿的发育受限，进而母体可出现瘙痒、出血等，胎儿可有宫内窘迫及发育受限，严重可致死胎[14]。本研究中也观察到zonulin、GPC3是ICP患者发生不良妊娠结局的危险因素(P<0.05)。zonulin的升高加重肠道功能障碍，细菌内毒素及各类胆道代谢产物不断进入血液循环，GPC3升高导致肝细胞损伤，这些均是对母体肝胆系统的直接打击，是发生不良妊娠结局的隐患。ROC曲线也证实了二者对妊娠结局具有较好的预测价值，但仍需更大样本量进行验证。本研究多因素分析还表明，年龄、直接胆红素、总胆汁酸、纤维蛋白原水平是ICP患者发生不良妊娠结局的危险因素(P<0.05)。年龄的增长和凝血因子纤维蛋白原异常必然会导致产妇不良妊娠的发生风险增加。直接胆红素、总胆汁酸是反映机体肝胆系统的重要指标，肝胆系统的异常导致母体肝功能的异常，并最终对妊娠的结局产生影响[15]。

综上所述，ICP患者血清zonulin及GPC3水平升高，重度患者更高，与ICP患者的不良妊娠结局有关，对ICP患者的不良妊娠结局具有较好的预测价值。同时，本研究也存在样本数量较少，对ICP患者不良妊娠结局的危险因素分析不够全面的不足，有待后续研究的进一步开展。