miRNA-455- 3 p在乳腺癌组织中的表达及与紫杉醇耐药的关系△

嵇晓辉，姜丽娜，王娜，刘薇，杨金花#

郑州人民医院1病理科，2乳腺外科，郑州 450003

乳腺癌属于多基因异质性恶性肿瘤，在女性中 其发病率仅次于宫颈癌，且近年来其发病呈逐渐年轻化的趋势，对女性身心健康的影响极大，发病后患者多会出现胸痛、乳头内陷、乳头破碎等症状，早期多采用根治性手术治疗[1]。但由于乳腺癌早期临床症状无特异性，多数患者确诊时病情已进展至中晚期，错过了最佳的手术时机，只能依靠化疗稳定病情[2]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是常用的乳腺癌化疗药物，该药物具有促进微管蛋白聚合、抑制解聚的作用，可确保微管蛋白处于稳定状态，避免细胞有丝分裂，与靶向药物联合应用还能在减轻不良反应的同时提高治疗效果，长期治疗虽然能在一定程度上增加肿瘤细胞的敏感性，但也有可能产生较大的毒性[3]。因此，尽早明确乳腺癌的耐药机制，研发新型靶向治疗药物，在提高药物敏感性的同时减轻不良反应，才能保障整体治疗效果[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）作为保守的内源性非编码小RNA，其组织特异性较高，目前已有研究认为miRNA-455-3p能够调控肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[5]。此外，自噬相关蛋白12（autophagy related 12，ATG12）在多种恶性肿瘤中异常表达，与恶性肿瘤靶向治疗耐药存在一定关联，但在乳腺癌中的研究较少。基于此，本研究探讨乳腺癌组织中miRNA-455-3p的表达及与PTX耐药的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年7月至2021年7月郑州人民医院收治的乳腺癌患者。纳入标准：①符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2015版）》[6]中乳腺癌的诊断标准；②经病理检查确诊为乳腺癌，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期；③临床资料完整。排除标准：①对PTX过敏；②存在化疗禁忌证；③合并其他器官感染或肿瘤；④认知功能障碍，无法完全配合治疗；⑤接受过化疗或放疗。依据纳入和排除标准，本研究共纳入80例乳腺癌患者，年龄30～78岁，平均（54.41±5.62）岁；病程1～6年，平均（3.21±0.46）年；PTX敏感者40例，PTX耐药者40例；TNM分期：Ⅲ期60例，Ⅳ期20例。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA的表达水平

取80例乳腺癌患者的乳腺癌组织和相应癌旁组织，PTX耐药和PTX敏感乳腺癌患者的乳腺癌组织，液氮中冷冻，随后迅速置于-80℃冰箱中保存待检。采用Trizol法提取组织样品中的总RNA，然后采用miRNA反转录试剂盒合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作为模板，利用Primer 5设计引物，配制PCR反应体系，最后于荧光定量PCR仪上对miRNA-455a-3p表达水平进行检测，重复测量3次取平均值，以U6为内参，采用 2-△△Ct法计算 miRNA-455-3p 的相对表达量。miRNA-455-3p正向引物：5'-CGTCGAAGAAGGGCAAGTAG-3'，反向引物：5'-CACCATTCCAAGCACAACAC-3'；U6正 向 引 物 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用 2-△△Ct法计算 PTX 耐药和PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌组织中ATG12mRNA的相对表达量。ATG12正向引物：5'-CTGCTGCGGCGGGCGAGAG-3'，反向引物：5'-GGGCGAAACTGCAACCGAAGACG-3'；GAPDH正向引物：5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养和分组采用含有300 μg/ml PTX的RPMI-1640培养液培养人乳腺癌MCF-7细胞，24 h后更换为不含PTX的RPMI-1640培养液，一旦细胞融合度高达70%，则反复使用PTX诱导，并反复换液、传代，24周后建立PTX耐药细胞MCF-7/PTX。将MCF-7/PTX接种于96孔板中，1×105/孔，待细胞融合度达到50%，采用Lipofectamine 3000将miRNA-NC、miRNA-455-3p mimics分别转染至乳腺癌耐药MCF-7/PTX细胞，分别作为miRNANC组、miRNA-455-3p组。

1.3.2 蛋白质印迹法（Western blot）检测相关蛋白的相对表达量将细胞裂解液加入待裂解细胞中后，离心取上清液，并采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白对试剂盒中的蛋白质浓度进行测定，吸取50 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），随后于100 V恒压条件下将蛋白印迹转移到纤维素膜中，于4℃条件下采用5%脱脂牛奶封闭纤维素膜，并孵育过夜，随后加入P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽 S-转移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）一抗，室温下孵育2 h，采用TBST洗涤；加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1.5 h，随后采用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法对蛋白进行检测，同时利用Image Scanner软件分析P-gp、GST-π蛋白的相对表达量。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡能力将细胞接种于6孔培养板中孵育24 h，1×105/孔，PTX处理后继续培养48 h。胰蛋白酶消化细胞后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤重悬，随后取 100 μl细胞悬液加入 5 μl膜联蛋白 V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）孵育 10 min，然后加入 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）孵育15 min，采用流式细胞仪和Flowjo软件计算细胞凋亡率。

1.4 观察指标

①比较乳腺癌组织和癌旁组织中miRNA-455-3p的相对表达量。②比较PTX耐药和PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌组织中miRNA-455-3p、ATG12mRNA的相对表达量。③比较miRNA-NC组、miRNA-455-3p组MCF-7/PTX细胞的凋亡率以及P-gp、GST-π蛋白的相对表达量。④分析乳腺癌组织miRNA-455-3p的表达与ATG12表达的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对所有数据进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织和癌旁组织中miRNA-455- 3 p相对表达量的比较

乳腺癌组织中miRNA-455-3p的相对表达量为（1.01±0.03），明显高于癌旁组织的（0.73±0.03），差异有统计学意义（t=59.029，P＜0.01）。

2.2 PTX敏感和PTX耐药乳腺癌患者乳腺癌组织中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相对表达量的比较

PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌组织中miRNA-455-3p的相对表达量明显高于PTX耐药患者，ATG12mRNA相对表达量明显低于PTX耐药患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 PTX敏感和PTX耐药乳腺癌患者乳腺癌组织中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相对表达量的比较（±s）

表1 PTX敏感和PTX耐药乳腺癌患者乳腺癌组织中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相对表达量的比较（±s）

PTX耐药情况PTX敏感（n=40）PTX耐药（n=40）t值P值1.02±0.02 0.68±0.04 48.083 0.000 0.63±0.08 1.29±0.12 28.943 0.000 miRNA-455-3p ATG12 mRNA

2.3 miRNA-455- 3 p过表达对乳腺癌细胞MCF- 7/PTX凋亡情况及P-gp、GST- π蛋白相对表达量的影响

miRNA-455-3p组细胞凋亡率明显高于miRNANC组，P-gp、GST-π蛋白相对表达量均明显低于miRNA-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 miRNA-455- 3 p组和miRNA-NC组MCF- 7/PTX细胞凋亡情况及P-gp、GST-π蛋白相对表达量的比较（±s）

表2 miRNA-455- 3 p组和miRNA-NC组MCF- 7/PTX细胞凋亡情况及P-gp、GST-π蛋白相对表达量的比较（±s）

组别miRNA-NC组miRNA-455-3p组t值P值8.41±0.42 16.84±0.52 56.401 0.000 1.06±0.11 0.46±0.06 21.415 0.000 1.02±0.08 0.47±0.05 26.073 0.000凋亡（%）P-gp蛋白GST-π蛋白

2.4 miRNA-455- 3 p表达与ATG12表达的相关性

Spearman相关分析结果显示，乳腺癌组织中miRNA-455-3p的表达与ATG12的表达呈负相关（r=-0.697，P＜0.01）。

3 讨论

乳腺癌的发病机制较为复杂，目前临床尚未完全明确，可能与遗传、外源性雌激素刺激、不良生活习惯等因素有关[7]。化疗作为乳腺癌常见的辅助治疗方法之一，以PTX最为常见，该药可有效抑制病情进展，治疗效果显著，但若患者对PTX产生耐药性，极有可能增加化疗失败、肿瘤转移的风险，甚至还有可能缩短患者的生存期，严重影响患者的预后[8]。因此，临床只有尽早明确乳腺癌组织产生PTX耐药的原因，才能及时采取有效的措施进行干预，进而降低乳腺癌组织对PTX的耐药性，达到提高患者临床治疗效果的目的[9]。

miRNA含有20～24个核苷酸，可通过与靶基因3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）完全或不完全结合的方式对靶基因和蛋白翻译功能进行降解和抑制，使miRNA调控信号通路出现异常[10]。目前已有研究证实，肿瘤内的miRNA与化疗药物的耐药性存在一定关联[11]。miRNA-455-3p是功能性miRNA的一种，可在多种恶性肿瘤耐药性的产生过程中发挥调控作用，但miRNA-455-3p对乳腺癌PTX耐药的影响及其调控机制仍有待进一步研究[12]。目前也有研究认为自噬与肿瘤细胞耐药性存在一定关联，ATG12作为自噬小体形成的主要参与因子之一，可诱导自噬小体的形成促进自噬的发生，自噬的发生能够诱导肿瘤细胞对治疗的抵抗[13-14]。相关研究认为，miRNA可在调控ATG12的表达后，直接参与肿瘤耐药性的产生过程[15-16]。本研究也认为miRNA-455-3p与ATG12的表达存在关联，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中miRNA-455-3p的相对表达量明显更高，且PTX敏感组织中miRNA-455-3p的相对表达量明显高于PTX耐药组织，而ATG12mRNA的相对表达量明显低于PTX耐药组织。提示ATG12可能是miRNA-455-3p的潜在靶基因之一，且ATG12还可能在PTX的作用下对耐药细胞的自噬和凋亡产生影响，从而干扰miRNA-455-3p的表达，增强乳腺癌的耐药性。

P-gp蛋白作为多药耐药基因编码的产物，可将PTX泵出细胞外，同时还能对肿瘤细胞的生长、凋亡产生调节作用[17-18]。GST-π蛋白可使细胞毒性药物参与到化疗中，使化疗耐药，而下调P-gp和GST-π蛋白的表达可逆转乳腺癌细胞的耐药性，抑制P-gp和GST-π蛋白的表达还能有效逆转miRNA-455-3p对MCF-7/PTX细胞凋亡的影响[19-20]。本研究结果显示，miRNA-455-3p组细胞凋亡率明显高于miRNA-NC组，P-gp、GST-π蛋白的相对表达量均明显低于miRNA-NC组，提示miRNA-455-3p高表达可能抑制了乳腺癌PTX的耐药过程，干扰miRNA-455-3p的表达可能增强乳腺癌组织的耐药性。但本研究仅为单中心研究，且样本量较少，后续还需要加大样本量，并进行多中心分析，才能进一步提高研究结果的真实性和可靠性。

综上所述，乳腺癌组织中miRNA-455-3p表达与PTX耐药存在一定关联，miRNA-455-3p能够靶向抑制ATG12的表达，降低耐药乳腺癌细胞的自噬活性，促进细胞迅速凋亡，最终改善乳腺癌细胞对PTX的敏感性。