α-烯醇化酶1 对非小细胞肺癌侵袭转移的影响

赵心宇，王恩琴，卢韬，张丽红

1.绍兴文理学院医学院，浙江绍兴 312000；2.绍兴市人民医院医学检验科，浙江绍兴 312000

最新癌症统计报告显示，肺癌是全球癌症死亡的最主要原因，每天有超过350 人死于肺癌，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占85%[1]。NSCLC 恶性程度高、进展快，早期缺乏典型的临床症状，一经发现大多为中晚期，治疗手段和疗效均有限。我国NSCLC 患者的5 年生存率仅为19.7%[2]，因此，研究NSCLC 侵袭转移的相关分子机制，对发现新的治疗靶点，改善患者预后具有重要意义。α-烯醇化酶1（alpha-enolase 1，ENO1）是烯醇化酶的3 种亚型之一，属于糖酵解过程中重要的限速酶，能够催化2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸。近年来多个研究发现ENO1 在多种类型肿瘤的发生、发展中均具有重要作用。既往研究显示在肺癌患者的癌组织和外周血中，ENO1 表达升高，且对肺癌患者早期诊断具有一定价值[3]，但ENO1 对NSCLC 的生物学功能有何影响尚不明确。本研究旨在探讨ENO1 对NSCLC 侵袭转移和增殖的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人NSCLC细胞株A549、H460（中国科学院细胞库，上海）；ENO1、GAPDH单克隆抗体及抗兔抗体（Abcam公司，美国）；RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒（博士德生物工程有限公司，武汉）；ENO1-小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（锐博生物科技有限公司，广州）；Lipo6000TM转染试剂、CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司，上海）；ENO1、内参GAPDH引物（生工生物股份有限公司，上海）；One Step SYBR RT-qPCR Kit（Takara公司，日本）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、PMSF（北京索莱宝生物科技有限公司）；Biolonase核酸酶（拜朗生物科技有限公司，上海）；蛋白Marker（Invitrogen公司，美国）；Transwell小室（Corning公司，美国）。

1.2 生物信息学分析

利用TCGA 数据库（https://gdc-portal.nci.nih.gov/）分析ENO1在肺腺癌和肺鳞癌中的表达差异及与患者肿瘤分期之间的关系；Kaplan-Meier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/）用于分析肺腺癌和肺鳞癌中ENO1表达水平对患者生存率的影响；利用GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE30219数据集分析272 例NSCLC患者的ENO1相对表达量，探讨ENO1与NSCLC临床病理指标的相关性。

1.3 细胞培养和转染

将H460、A549细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养条件为37℃、5%CO2的湿润培养箱；当细胞处于对数生长期时接种于6孔板中，24h后细胞融合度达70%～90%，利用Lipo6000TM转染试剂瞬时转染。实验分为实验组（siRNA干扰）及对照组。

1.4 实时定量聚合酶链反应

利用RNA提取试剂盒提取上述转染24h后细胞的全部RNA，实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）一步法验证转染效率。

1.5 蛋白质印迹实验

提取转染48h后的A549及H460细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，煮沸变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白湿转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2h，加入一抗（ENO1、GAPDH）后4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2h，ECL显色后曝光测试。

1.6 CCK-8 实验

收集各组细胞并按2×104个/孔（100μl）的密度接种至96孔板中，分别在铺板后24h、48h、72h，向各孔加入10μl CCK-8检测液，继续培养2h，酶标仪检测各孔450nm吸光度（A450）。

1.7 划痕实验

取对数期细胞均匀铺在6孔板中，进行转染，转染结束待细胞生长密度至90%左右，用10μl无菌移液枪枪头在6孔板中划十字划痕，磷酸盐缓冲液清洗3次，换用无血清培养基培养。分别在0h、24h、48h镜下观察划痕的改变情况并拍照记录。

1.8 Transwell 侵袭实验

用不含胎牛血清的DMEM培养基以1 ∶8稀释Matrigel胶基质，将Transwell小室置于24孔板中，取50μl稀释胶加至小室上室面，37℃孵育3h。取各组对数生长期细胞，调整细胞密度为1.5×105/L，每孔加入100μl细胞悬液至Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。常规培养48h后，用4%多聚甲醛固定、结晶紫染液染色，200倍显微镜视野下随机选取5个视野拍照，Image J软件进行细胞计数并分析。

1.9 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料用例数（百分率）[n（%）]进行描述，组间比较采用χ2检验，计量资料以中位数（四分位数间距）M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学数据库分析

2.1.1 ENO1在NSCLC的表达及其与TNM分期的关系从TCGA数据库得到肺鳞癌（502例癌组织及49例正常组织）和肺腺癌（535例癌组织和59例正常组织）中ENO1的表达量，发现与正常组织相比，ENO1在肺鳞癌及肺腺癌中的表达均显著升高（P<0.001），见图1A、F。肺鳞癌中ENO1表达水平与分期无关。Ⅱ～Ⅳ期肺腺癌中ENO1 的表达水平显著高于Ⅰ期（P<0.001），见图1B，N1～N3期肺腺癌中ENO1的表达水平显著高于N0期（P<0.001），见图1D。

图1 TCGA数据库中ENO1在NSCLC中的表达

2.1.2 数据库分析ENO1与NSCLC患者预后的关系利用Kaplan-Meier Plotter数据库探索ENO1表达水平与患者总生存之间的关系，结果显示无论是肺腺癌还是肺鳞癌，ENO1的表达水平越高，患者预后越差（P<0.05），见图2。

图2 ENO1表达水平与肺腺癌、肺鳞癌患者的预后关系

2.1.3 数据库分析ENO1与NSCLC患者临床特征的关系 分析GEO数据库中272例NSCLC患者的临床资料，结果显示，ENO1表达水平与患者组织学分型及是否复发显著相关（P<0.001），与患者的TNM分期、年龄、性别及是否复发无相关性（P>0.05），见表1。

表1 ENO1 与NSCLC 患者临床特征的相关性（例）

2.2 干扰ENO1 表达效果验证

应用RT-qPCR和蛋白质印迹法验证ENO1干扰效果，结果显示A549、H460细胞转染si-ENO1后，mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组（P<0.001），见图3。

图3 siRNA 干扰ENO1 效果验证

2.3 干扰ENO1 表达对NSCLC 细胞增殖能力的影响

CCK-8 实验结果显示，A549、H460 细胞经转染后，48h 及72h 的OD 值均显著低于对照组（P<0.05），见图4。

图4 CCK-8 实验检测细胞增殖能力

2.4 干扰ENO1 表达对NSCLC 细胞迁移能力的影响

划痕实验发现，与对照组相比，干扰ENO1 表达后A549 及H460 细胞迁移能力均减弱（P<0.05），见图5。

图5 划痕实验检测细胞迁移能力(×100)

2.5 干扰ENO1 表达对NSCLC 细胞侵袭能力的影响

Transwell 实验结果显示，与对照组相比，干扰ENO1 表达后A549 及H460 细胞体外侵袭能力均减弱（P<0.05），见图6。

图6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力

3 讨论

ENO1 又称为2-磷酸-D-甘油水解酶，主要存在于细胞膜和细胞质中，具有催化糖酵解过程、维持线粒体膜稳定性、调节信号通路、促进纤溶酶形成等多种生物学功能[4-7]。ENO1 能够促使恶性肿瘤细胞发生Warburg 效应，使其通过有氧糖酵解途径利用葡萄糖，同时降低线粒体内的有氧磷酸化，让肿瘤细胞实现无限增殖[8-10]。此外，定位于细胞膜表面的ENO1 能够结合并活化纤溶酶原，使肿瘤细胞发生侵袭转移；还可增强单核巨噬细胞的浸润能力，其机制可能是通过Notch 信号通路进而控制c-myc 癌蛋白的表达，参与肿瘤形成[11]。研究表明，ENO1 的表达水平与多种恶性肿瘤的预后显著相关[12-13]。Jiang 等[14]发现外泌体来源的ENO1 可通过上调整合素α6β4 的表达，实现FAK/Src-p38MAPK 途径的激活从而促进肝细胞癌的生长和转移。而在胃癌细胞中，ENO1 主要通过调节Akt 信号通路促进肿瘤的增殖和转移[15]。此外，在乳腺癌、膀胱癌、大肠癌中均发现ENO1 能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[12,16-17]。课题组前期研究显示，ENO1 在肝癌组织中高表达，且具有促进肝癌细胞侵袭转移的作用[18]。这些结果表明ENO1 在肿瘤发生发展中具有重要作用。

本研究通过生物信息学数据库分析，发现ENO1在NSCLC 组织中高表达，TNM 分期结果显示ENO1在肺腺癌中与患者分期有关，且仅与淋巴结转移有关，ENO1 的高表达与肺腺癌及肺鳞癌患者的预后不良有关，ENO1 的表达水平与患者组织学分型及是否复发显著相关。但课题组前期研究结果显示肺癌患者血清和组织中ENO1 的表达与性别、组织学分型无关，且Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者ENO1 表达也高于Ⅲ～Ⅳ期患者，两者结论不符，分析原因可能是课题组前期检测样本量较少，且以Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者为主，病理类型大多为肺腺癌，缺少其他病理类型的样本，还有待加大样本量进一步证实。本研究利用CCK-8实验、划痕实验、Transwell 实验证实，干扰ENO1表达后NSCLC 细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱，提示ENO1 具有促进肿瘤侵袭转移的作用。

本研究也存在不足之处。NSCLC 是除小细胞肺癌以外、所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合体，常见类型有鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。但本实验使用的A549、H460 细胞株分别为肺腺癌和大细胞肺癌，对于肺鳞癌及其他少见类型的NSCLC 细胞系尚未验证ENO1 的生物学功能，未来将进一步增加相应的细胞系进行研究。另外，对ENO1 促进NSCLC 侵袭转移的作用机制研究不够深入，ENO1在肿瘤免疫方面充当何种角色，是否能作为NSCLC的一种新型免疫治疗位点，其具体作用机制又是如何，这也是未来研究的主要方向。

综上所述，ENO1在NSCLC中高表达，且其表达水平与患者预后相关，ENO1具有促进NSCLC侵袭转移的作用，有可能成为新的NSCLC生物标志物及治疗靶点。