四种抗氧化剂对猪精液冷冻保存影响研究进展

冯赫泽，宋宇伦，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

猪作为重要的畜牧产品正受到越来越多的关注。为了保证生产效率和生产质量，现在多采用人工授精进行大规模生产养殖。目前保存方法多采用常温下17℃保存、4℃的低温保存、超低温-79℃（干冰）或-196℃（液氮）三种保存方法。随着人工授精技术在养猪业的普及，对猪精液保存技术的研究正在逐步深入。猪精液可以在常温下短时间保存，并且精子活力和质量也受许多因素影响。与冷冻精液相比，常温保存的精液受孕率高、投资少、人工操作方便，可产生较大的经济效益。因此与其他方法相比，常温保存精液是猪人工授精的首要选择。虽然常温保存技术被广泛应用，但冷冻精液在储存、运输、使用地域、抵抗疫病、节约配种成本、降低育种强度方面与常温精液相比优势显著。目前，由于猪精子结构的特殊性，猪精液冷冻保存技术始终没有获得突破性进展，世界上应用猪冻精进行人工授精所占的比例不到1%。因此，可以尝试通过研究例如没食子酸、丹参素和迷迭香酸等在猪精液冷冻保存中的抗氧化能力，并选取出效果相较最佳的抗氧化剂加入到冷冻稀释液中，以便在猪生产实践中提高生产效率。

1 猪精液冷冻保存技术发展现状

猪精液冷冻保存技术主要是将猪精子储存在液氮（-196℃）或干冰（-79℃）中，使精子能够置于冷冻环境中，进而使细胞代谢几乎停止，达到长期保存的目的。目前，中国生猪养殖主要以利用新鲜精液人工授精繁殖为主，但鲜精体外保存时间较短，且精子质量下降较快，极大地影响了公猪精液的利用效率。虽然研究人员已对猪精液冷冻保存技术开展了大量研究，并改进和开发了冷冻稀释液和保护剂的配方，但其实际应用结果仍不理想。原因在于猪精子的结构与牛羊不同，其精液冷冻机理始终不如牛羊等动物清晰明确，也没有能生产与之匹配的冷冻试剂、解冻试剂和冷冻配套设备，猪冻精在解冻后的指标达不到生产应用的要求，在猪繁殖生产中难以推广应用，仅极小量用于引种育种。因此，在当前猪精液冷冻保存技术未完善之前，可优先选择在冷冻稀释剂中添加新型抗氧化剂，提高当前猪精液冷冻保存技术水平的生产效率。

2 四种抗氧化剂在猪精液冷冻保存中的应用

2.1 维生素E

维生素E，又名α-生育酚，其发生的抗氧化作用，内源性和外源性产生的活性氧（ROS）引起氧化还原平衡的变化与各种疾病有关，也是一种被认为是生存所必需的现象。维生素E为了调节由于其脂肪中可溶性维生素的浓度较高而导致的体内氧化还原平衡，并普遍存在于个体内，包括细胞膜和脂蛋白。因此维生素E在维持精细胞膜的稳定性，抑制自由基在精子形成方面具有重要作用，可使精子顶体完整率得到有效提升并降低精子畸形率、改善精液品质。任俊玲等人的试验证明，添加0.2 mg/mL维生素E可有效提高冷冻-解冻精子活力、活率、质膜完整率，并且能显著减少MDA（丙二醛）的生成。但需要注意的是，维生素E若添加过量，在细胞膜抗脂质过氧化过程中，维生素E转化为自由基，对精子造成损害。李芳研究发现，在冷冻稀释液中添加0.6 mg/mL的维生素E可以有效提升SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）的活性，有效防止脂质过氧化，对细胞膜的结构和功能起到保护作用。并且发现，同时添加维生素E和PUFA（多不饱和脂肪酸）对猪精子的冷冻效果要优于单独添加维生素E。张树山发现，在冷冻保存液中加入维生素E可以改善猪精液冻后活率和顶体完整率，当加入水平为600 μg/mL时，活率和顶体完整率得到明显提高，精液的冻后活率和顶体完整率均随着加入水平的上升而改善，但在超过一定水平后反而下降。由此（表1）可见，维生素E在猪精液保存技术当中具有重要作用，但单独使用维生素E的猪精液保存效果已趋近饱和，目前可尝试使用两种或多种抗氧化剂与维生素E组合进行猪精液冷冻保存效果的研究。

表1 维生素E在猪精液冷冻保存中的应用

2.2 没食子酸

没食子酸（GA，Gallic acid）是一种多酚类有机化合物，多从掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中提取，在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用。没食子酸作为具有强抗氧化性的一类天然酚酸，目前已被国家批准为可以用作食品的主要抗氧化剂使用，除了抗氧化之外没食子酸还具备抗菌功能，对大肠杆菌感染和革兰氏阴性菌具有很强的抑制作用。实验证明，向冷冻保存培养基中添加50 μg/mL没食子酸可显著改善人的精子形态、活率、活力和DNA完整性，并减少DNA片段化和脂质过氧化。ⅰnanç ME等人在Honameli山羊精液冻融后，在Tris基精液稀释液中添加浓度为1 mmol/L的GA对Honamli山羊精液冻融后的精子参数均产生积极效应。因此应继续使用不同剂量和制剂组合对其他物种进行进一步研究。Gungor S等人在Tris基稀释液中冷冻保存公羊精液时补充2 mmol/L GA可增加猪精子解冻后的运动能力，而补充0.05 mmol/L GA可增强线粒体功能（见表2）。目前，没食子酸在猪精液冷冻保存技术当中的研究应用甚少，未来将会是重要的研究方向。

表2 没食子酸在精液冷冻保存中的应用

2.3 丹参素

丹参素是一种优秀的天然抗氧化剂，该化合物大量存在于中草药丹参中，能清除超氧阴离子，保护细胞线粒体不受氧自由基脂质过氧化的影响。使超氧化物歧化酶（SOD）的含量提升，降低自由基产物丙二醛（MDA）的含量，对心血管疾病和其他健康问题具有治疗作用，这些作用背后的机制包括抗氧化、抗凋亡等。因此有试验表明，添加丹参多糖（SMP）可显著提高解冻后的精子活率、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、过氧化氢酶活性。在冷冻过程中，SMP能防止猪精子发生过氧化损伤，提高冷冻-解冻过程中的精子活力和产仔数。在猪精液常温保存稀释液中添加不同浓度的丹参素能够不同程度地改善精液保存质量。其中，25 μmol/L丹参素使精子活率、质膜和顶体完整率、T-AOC（总抗氧化）水平和SOD活性得到有效提升，MDA含量明显下降。Xuekai Tian等人试验证明，17℃下不同浓度丹参素加入猪精液稀释溶液保存效果不同。与对照组相比，补充丹参素的猪精液样品表现出的氧化应激对精子的影响降低。补充30 μmol/L丹参素能使精子活力、质膜完整性、顶体完整性和抗氧化能力显著提升。由表3可以看出，丹参素对猪精子具有显著的保护作用，研究价值潜能巨大。但目前相关研究甚少，未来可尝试将丹参素应用于猪精液的冷冻保存技术并分析出最佳添加剂量，进一步提高猪精液的冷冻保存效果。

表3 丹参素在猪精液保存中的应用

3 讨论

目前，猪精子抗氧化作为猪精液冷冻保存技术当中最为重要的环节，由于猪精液在冷冻-解冻过程中精子细胞膜磷脂不饱和脂肪酸浓度与牛羊相比较高，更易受到ROS（活性氧）攻击，导致抗氧化能力降低造成猪精子的氧化损伤。因此目前抗氧化剂的研究尤为重要，对提高生猪繁殖性能、扩大生猪养殖及发展畜牧产业具有重要意义。天然提取物作为保存精液的抗氧化剂，具有广阔的研究空间和发展前景，这对于提高人工授精技术的生产力和降低授精成本也起着重要作用。

表4 迷迭香酸在猪精液保存中的应用