血小板衍生细胞外囊泡在儿童IgA血管炎肾损伤患者中的表达及意义*

张 菂，刘 宁，王彩芳，陈瑞珊，海 冬，杨文浩

(开滦总医院：1.儿科；2.肿瘤科；3.风湿免疫科，河北 唐山 063000)

免疫球蛋白A血管炎肾损伤(IgAVN)又名紫癜性肾炎，是儿童最常见的血管炎性肾脏疾病，发病机制尚未完全明确[1]。血小板衍生细胞外囊泡(PEVs)是血小板表面以芽出形式脱落的微小颗粒。研究表明，PEVs参与细胞间通讯、诱导免疫刺激和免疫活化，是具有研究前景的自身免疫性疾病生物标志物[2]。PEVs直径为0.1～1.0 μm，表面表达CD42、CD61等标记，也是血小板活化标记之一[3]。国外的研究提示，儿童血管炎患者中血浆PEVs增高[4]，但在儿童IgAVN中血浆PEVs增高尚缺乏研究。本研究通过检测IgAVN患儿血浆PEVs水平，分析PEVs与IgAVN不同临床表型的相关性，探讨PEVs在儿童IgAVN患者中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究以2017年6月至2020年6月于开滦总医院儿科住院的免疫球蛋白A血管炎(IgAV)患儿92例(观察组)建立回顾性研究队列，所有患儿均满足欧洲风湿病联盟/儿童风湿病国际研究组织/儿童风湿病联盟2010年制定的IgAV诊断标准[5]。另选取50例参加体检、年龄性别匹配的健康儿童作为健康对照组。以住院期间是否满足中华医学会儿科学分会肾脏学组IgAVN诊治循证指南(2016)诊断标准[6]，将研究对象分为IgAVN组(42例)与无肾脏损伤的IgAV组(50例)。纳入标准：(1)符合IgAV诊断标准；(2)同意参加本研究并签署知情同意书。排除标准：(1)临床资料不完整者；(2)有其他感染性疾病、营养不良、自免疫性疾病、免疫系统缺陷及先天遗传代谢障碍性疾病者；(3)已用免疫调节剂治疗者；(4)拒绝参加本研究者。本研究遵照赫尔辛基宣言，经开滦总医院伦理委员会批准(开医伦2019-12)。

1.2 方法

1.2.1主要试剂及仪器

流式细胞分析仪购于美国GE公司。荧光素标记的鼠抗人抗血小板单克隆抗体(CD42b-PE)购于美国BD公司。

1.2.2PEVs检测

基于既往文献中使用的方法，检测研究对象外周血PEVs[7]。所有研究对象均于入院第2天、门诊就诊当天或体检当天，采用流式细胞仪检测血浆PEVs。研究对象晨起采集空腹静脉血，即刻引入枸橼酸盐抗凝管，以1 000 r/min的转速运行10 min获取富血小板血浆，再将其以3 500 r/min的转速运行15 min获取贫血小板血浆。将贫血小板血浆冰上解冻，取50 μL贫血小板血浆，加入5 μL 藻红蛋白标记的CD42(CD42-PE)充分混合孵育20 min，再加入40 μL荧光计数微球充分混合，加入1 mL生理盐水缓冲液。采用流式细胞仪对样品进行分析。以CD42b荧光散点图阳性范围作为第一设门区域，再以前向散射光(FSC)/侧向散射光(SSC)坐标<1.0 μm微球荧光强度以下作为第二门区域。根据荧光计数微球计算PEVs水平。当门内收集到10 000个微粒时停止计数，依据PEVs所占百分比计算血浆PEVs数量。

1.2.3临床资料的收集

由专业儿科医师收集IgAV患儿住院期间临床资料，包括临床症状、实验室检查结果，如关节炎发生情况，血常规、尿常规，超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、红细胞沉降率(ESR)、抗溶血性链球菌“O”(ASO)、总免疫球蛋白E(IgE)、血浆D二聚体、纤维蛋白原水平，便潜血情况等。

1.2.4随访时间与终点事件

所有IgAV患儿均于出院后第2、4、12周到儿科门诊复诊，复诊时据患者尿常规、尿蛋白肌酐比结果确定肾损伤情况。未能复诊者由专科医师电话追踪和了解其肾脏损伤情况。非IgAVN患儿随访至出现肾损伤，如无肾损伤发生则随访至出院后12周；IgAVN患儿随访至出院后12周。随访由儿科专科医师进行。终点事件包括迟发IgAVN和慢性IgAVN。迟发IgAVN：住院期间未诊断IgAVN而随访期间出现血尿或尿蛋白肌酐比>0.2 mg/mg；慢性IgAVN：住院时至随访结束时持续存在血尿或尿蛋白肌酐比持续>0.2 mg/mg。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 研究对象一般情况及PEVs水平比较

观察组男52例，女40例，平均年龄(7.12±3.09)岁，健康对照组男26例，女24例，平均年龄(7.09±2.65)岁，两组间性别(χ2=0.127,P=0.962)、年龄(t=-0.857,P=0.670)比较差异无统计学意义。观察组血浆PEVs水平为(296.94±24.37)个/μL，明显高于健康对照组的(225.67±34.13)个/μL，差异有统计学意义(t=13.44,P<0.001)。

2.2 不同组别IgAV患儿临床特征比较

IgAVN组年龄和血浆PEVs水平高于IgAV组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而两组间性别分布差异无统计学意义(P=0.062)。此外，IgAVN组便潜血阳性患儿百分比、白细胞计数、总IgE、ESR、Hs-CRP、血浆D二聚体和纤维蛋白原水平高于IgAV组，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组间合并关节炎患儿百分比、血小板计数、补体C3和ASO水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同组别IgAV患儿之间的临床特征比较

2.3 血浆PEVs水平与住院期间IgAVN临床特点的相关性分析

Person相关分析显示，血浆PEVs水平与IgAVN患儿总IgE、Hs-CRP、白细胞计数、ESR、血浆D二聚体水平呈正相关(P<0.05)，而与年龄和纤维蛋白原水平无明显相关性(P>0.05)。Spearman相关分析显示，血浆PEVs水平与便潜血阳性百分比呈正相关(P<0.05)。

表2 PEVs与IgAVN临床指标的相关性分析

2.4 血浆PEVs水平与迟发IgAVN和慢性IgAVN的Poisson回归分析

IgAV组平均随访(10.27±3.24)周，失访9例，总失访率为18.00%，检出迟发IgAVN患儿10例(24.39%)；IgAVN组平均随访(10.27±1.6)周，失访3例，总失访率为7.14%，确定慢性IgAVN患儿7例(17.95%)。分别以迟发IgAVN(0=否，1=是)和慢性IgAVN(0=否，1=是)为因变量，年龄、便潜血阳性百分比、总IgE、补体C3、Hs-CRP、血浆D二聚体和基线血浆PEVs为自变量，行GEE-Poisson回归分析。结果显示，校正年龄、便潜血阳性百分比、总IgE、Hs-CRP、血浆D二聚体等指标后，血浆PEVs水平与迟发IgAVN发生风险增加相关(RR=1.22,95%CI=1.05～1.44，P=0.026)，与慢性IgAVN发生风险增加无关(RR=1.14,95%CI=0.91～1.67，P=0.083)。见表3、4。

表3 迟发IgAVN的Poisson回归分析

表4 慢性IgAVN的Poisson回归分析

3 讨 论

IgAVN累及50%以上的IgAV患儿，是影响IgAV远期预后的首要因素[8]。IgAVN主要的病理改变为血管炎；内皮受损、中性粒细胞浸润和免疫复合物沉积是血管炎肾脏损伤的特征[9]。基础研究证实，血管内皮损伤、体内存在自身免疫反应及急性炎症时，血小板会释放PEVs[10-11]。IgAVN发病机制中的多个环节均可导致PEVs水平升高，因此，患儿体内血浆PEVs水平可能反映IgAVN的病情变化。

在多种血管炎性疾病如抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎[12]和系统性红斑狼疮[13]的研究表明，血管炎介导肾炎患者体内PEVs升高，而抑制PEVs释放与血管炎介导的肾脏损伤改善有关[14]。目前，PEVs在儿童IgAVN中的表达缺乏研究。本研究中，观察组患儿血浆PEVs水平明显高于健康对照组，而IgAVN组患儿血浆PEVs水平也高于IgAV组，提示PEVs可能与IgAV病情活动及肾脏损伤有关。进一步分析发现，血浆PEVs水平增高与IgAVN患儿病情活动性指标如总IgE、Hs-CRP、白细胞计数、ESR、血浆D二聚体相关，提示PEVs水平反映了儿童IgAVN的病情活动和其他内脏损伤情况。此外，消化道损伤是IgAVN的严重并发症，PEVs水平与便潜血阳性百分比相关，提示高PEVs水平时患儿病情更加严重。早期准确评估病情，制订针对性治疗方案是改善IgAVN预后的关键，但目前IgAVN最有效的评估方法为肾脏活组织病理检查[15]。鉴于其有创性，临床开展仍存在困难，寻找可靠的IgAVN血清标志物具有重要临床价值。本研究结果显示，PEVs水平可作为有效评价IgAVN病情活动和严重程度的客观指标。

尽管多数IgAVN患儿早期即出现尿检异常，但仍有部分IgAVN发生于病程中期或后期[16]。由于缺乏简便易行且具有特异性的预测指标，此部分患儿的诊断和治疗常常延迟，预后受到影响。本研究中，IgAV组平均随访(10.27±3.24)周，检出迟发IgAVN患儿10例(24.39%)，Poisson回归结果表明，基线血浆PEVs水平是随访期内出现肾脏损伤的独立危险因素(RR=1.22)。尽管研究结果中年龄、便潜血阳性百分比、总IgE、Hs-CRP也与迟发性IgAVN相关，但年龄、便潜血阳性百分比、总IgE也与慢性IgAVN有关，并不具有特异性。基线血浆PEVs与Hs-CRP均仅与迟发性IgAVN相关，且基线血浆PEVs水平与迟发性IgAVN相关性强于Hs-CRP，因此基线血浆PEVs水平是评估迟发性IgAVN发生风险的更优指标。迟发性IgAVN的发生与调节性T细胞功能减弱有关[17]。调节性T细胞可负向调控过激的免疫反应，其功能受到抑制，可导致自身免疫反应持续存在，进而发生器官损伤。试验表明，调节性T细胞表面FoxP3的表达下调与PEVs 水平升高有关[18]。

成人血浆PEVs水平与慢性肾功能不全有关[19]，但PEVs是否与IgAVN慢性化相关并不确定。本研究中，IgAVN组确定慢性IgAVN患儿7例(17.95%)，而基线血浆PEVs水平与慢性IgAVN之间不具有明显相关性。因此，PEVs可能并未参与儿童IgAVN的慢性化过程，而仅仅是急性期亢进的自身免疫和过激炎症反应的结果。此外，研究结果还显示，发病年龄、便潜血阳性百分比和总IgE与慢性IgAVN有关。这一结果与WANG等[20]和NOSSENT等[21]的研究一致，均表明发病时年龄较大、合并消化道损伤和过敏因素持续存在会增加IgAVN的发生风险。

综上所述，IgAVN患者血浆PEVs水平显著升高，PEVs水平与IgAVN病情活动和严重程度有关，并与迟发IgAVN的发生风险增加有关，而与IgAVN的慢性化无关。血浆PEVs水平可用于儿童急性IgAVN病情活动和迟发IgAVN发生风险的评估，但这一结论还需在大样本量研究中进行验证。