红霉素抑制PI3K/Akt通路增加Nrf2蛋白表达减轻烟草烟雾暴露下单核细胞炎性反应的效果研究*

孙雪皎，陈 琳，陈 慧，李 程，蓝官引

(柳州市人民医院呼吸与危重症医学科，广西柳州 545006)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是累及肺部及全身的慢性炎症性疾病，疾病呈进行性发展，严重的COPD致残率及致死率较高，会影响患者生活质量，给患者带来极大的心理负担及经济负担。烟草烟雾及环境污染等可引起氧化应激，导致氧化损伤，进而直接损伤气道上皮、加重气道的炎症反应，亦可导致蛋白酶抗蛋白酶失衡等，最终导致气流受限[1-2]。患者脱离氧化应激环境后气流受限不能完全逆转，呈持续性的气流受限，这是导致COPD发生、发展的主要原因之一。

红系衍生的核因子相关因子2(Nrf2)是具有调节抗氧化基因、维持细胞内氧化还原平衡、抑制凋亡及炎症等多种生物活性的关键转录因子，其与多种细胞因子相互关联，从而发挥多重保护作用[3-4]。Nrf2与氧化应激、炎症反应、呼吸系统疾病、恶性肿瘤、癌前病变及心血管疾病等的发生、发展有着密切的联系[5-6]。近年来，研究发现Nrf2在COPD的发生、发展中具有重要作用[7-8]。有研究表明，PI3K信号通路激活Nrf2，进而对抗氧化应激，维持氧化/抗氧化平衡[9]。然而，是否有药物可以通过作用于Nrf2进而改善COPD患者的炎症反应，国内外尚无类似研究。作者以此为切入点，以单核细胞株(U937细胞)为研究对象，观察红霉素是否能够通过作用于Nrf2蛋白的表达,减轻烟草烟雾暴露下单核细胞的炎症反应，同时验证在单核细胞炎症反应中，PI3K/Akt通路与Nrf2的关系，以及Nrf2是否受PI3K/Akt通路的调控。本研究将为COPD的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

以人U937细胞为研究对象，购于中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1分组

采用烟草烟雾提取物(CSE)制造细胞氧化应激模型，分为以下4组：空白对照组(n=3)，细胞培养液培养U937细胞，不给予红霉素及CSE干预；CSE组(n=3)，给予CSE刺激细胞过夜；红霉素组(n=3)，给予红霉素预孵育2 h后予CSE刺激过夜；抑制剂组(n=3)，给予PI3K/Akt抑制剂LY294002预孵育2 h后予CSE刺激过夜。根据转染Nrf2-siRNA干扰细胞Nrf2蛋白表达方式，分为以下6组：siRNA NC对照组(n=3)，采用细胞培养液培养，不给予红霉素及CSE干预；siRNA NC+CSE组(n=3)，给予CSE刺激细胞过夜；NC+CSE+红霉素组(n=3)，给予红霉素预孵育2 h后予CSE刺激过夜；Nrf2-siRNA组(n=3)，应用脂质体法Nrf2-siRNA转染U937细胞，转染后的细胞应用细胞培养液培养；Nrf2-siRNA+CSE组(n=3)，转染后的细胞给予CSE刺激细胞过夜；Nrf2-siRNA+CSE+红霉素组(n=3)，转染后的细胞给予红霉素预孵育2 h后予CSE刺激过夜。

1.2.2U937细胞的培养

U937细胞为悬浮细胞，采用由RPMI1640培养基及胎牛血清配置、含10%胎牛血清的培养基培养，于二氧化碳培养箱37 ℃、5%CO2环境中温育。培养基4 ℃存储。严格按照无菌操作，无菌台使用前打开紫外灯照射30 min，各种所需的容器、枪头等物品必须经高压灭菌消毒后才能用于细胞培养。应用脂质体法Nrf2-siRNA转染U937细胞。给予PI3K/Akt抑制剂LY294002预孵育2 h后予CSE刺激过夜。

1.2.3CSE的刺激及红霉素、抑制剂的干预

(1)CSE的制备与应用。将2支去过滤嘴燃烧的香烟烟雾由注射器驱动装置连续抽吸，将烟雾缓慢通入20 mL无血清的培养基中，制成悬液，放入密封瓶内，摇动使其充分溶解，应用紫外分光光度计(波长320 nm，吸光系数17.5)测量烟草烟雾提取物的浓度。(2)CSE及红霉素的水平确定。应用Brdu法确定试验中所应用的CSE及红霉素水平。(3)红霉素及抑制剂的干预。红霉素组给予红霉素预孵育2 h后予CSE刺激过夜；抑制剂组、CSE组应用细胞培养液代替红霉素，其余不变；空白对照组应用细胞培养液代替CSE及红霉素。经以上处理后，离心并获取上清液及细胞。

1.2.4各项指标的检测

(1)IL-8水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA，武汉华美生物工程有限公司)测定各组细胞上清液中IL-8的浓度。(2)Akt mRNA、Nrf2 mRNA及核因子(NF)-κB p65 mRNA水平。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组细胞中Akt mRNA、Nrf2 mRNA、NF-κB p65 mRNA的表达。(3)Akt、PAkt、Nrf2、NF-κB p65蛋白水平。采用Western blotting检测各组细胞内Akt、PAkt、Nrf2、NF-κB p65蛋白的表达。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 空白对照组、CSE组、红霉素组、抑制剂组IL-8水平比较

与空白对照组比较，CSE组IL-8水平明显升高，红霉素组、抑制组IL-8水平较CSE组下降(P<0.01)。见表1。

表1 不同细胞氧化应激模型组IL-8浓度比较

2.2 不同细胞氧化应激模型组细胞中Akt mRNA、Nrf2 mRNA及NF-κB p65 mRNA比较

不同细胞氧化应激模型组细胞中Akt mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。CSE组Nrf2 mRNA表达较空白对照组下降，NF-κB p65 mRNA表达升高；红霉素组和抑制剂组Nrf2 mRNA表达有所提高，NF-κB p65 mRNA表达降低。见图1。

*：P<0.01；#：P>0.05；ns:P>0.05。

2.3 不同细胞氧化应激模型组细胞中Akt、PAkt、Nrf2及NF-κB p65蛋白表达比较

4组细胞中Akt蛋白表达无明显差异。CSE组Nrf2蛋白达较空白对照组下降，PAkt及NF-κB p65蛋白表达升高；红霉素组和抑制剂组Nrf2蛋白表达有所提高，PAkt及NF-κB p65蛋白表达降低，但两组间无明显差异。见图2。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶，内参；+：加入；-：不加入。

2.4 不同干扰组中细胞Akt、PAkt、Nrf2及NF-κB p65蛋白表达比较

Nrf2-siRNA组Nrf2蛋白表达较siRNA NC组明显降低，但与Nrf2-siRNA+CSE组及Nrf2-siRNA+CSE+红霉素组比较无明显差异；Nrf2-siRNA组的NF-κB p65蛋白表达较siRNA NC组升高；siRNA NC+CSE组Nrf2蛋白表达较siRNA NC组降低，而NC+CSE+红霉素组较siRNA NC+CSE组表达升高；siRNA NC组与Nrf2-siRNA组的PAkt蛋白表达无差异，但siRNA NC+CSE组、Nrf2-siRNA+CSE组表达均升高，而NC+CSE+红霉素组、Nrf2-siRNA+CSE+红霉素组表达又再度降低。不同干扰组间Akt蛋白表达无明显差异。见图3。

+：加入；-：不加入。

3 讨 论

Nrf2活化受蛋白磷酸化的调控。目前认为，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI3K、蛋白激酶C(PKC)等信号通路分子广泛参与了Nrf2的活化和核转位过程，诱导Nrf2核转位的信号通路类型与诱导剂、细胞种类等因素相关。有研究表明，PI3K/Akt-Nrf2信号通路激活是兔内毒素休克诱发急性肺损伤时机体的适应性调节机制[10]。然而，在COPD炎症的发生与发展中，Nrf2的表达如何受PI3K/Akt通路调节尚不明确，是否有抗炎药物能够通过作用于PI3K/Akt-Nrf2信号通路减轻COPD的炎症反应，国内外尚无相关研究。

本研究结果表明，单核细胞经CSE刺激后炎症细胞因子水平提高，NF-κB p65升高，PI3K/Akt通路关键蛋白PAkt表达增加，Nrf2表达下降；经红霉素干预后炎症反应减轻，PAkt表达下降，而Nrf2水平升高。应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002作为本研究的阳性对照，其与红霉素有同样的效果。烟草烟雾刺激后单核细胞炎症反应增加，与PI3K/Akt通路激活、Nrf2蛋白表达下降有关，红霉素及通路抑制剂均可抑制PI3K/Akt通路活性，提高Nrf2蛋白的表达，进而减轻烟草烟雾暴露下单核细胞的炎症反应。为进一步证实PI3K/Akt通路与Nrf2蛋白的关系，作者转染Nrf2-siRNA干扰细胞中Nrf2蛋白的表达，应用siRNA NC组作为对照，结果表明，Nrf2-siRNA组的NF-κB p65蛋白表达较siRNA NC组升高，进一步证明Nrf2表达下降可导致炎症反应增加；而两组的PAkt蛋白表达无差异，证明Nrf2的变化不影响PI3K/Akt通路活性。结合前述实验结果，证明Nrf2在PI3K/Akt下游，受PI3K/Akt通路的调控，红霉素可通过作用于PI3K/Akt-Nrf2减轻烟草烟雾暴露导致的单核细胞炎症反应。

国外有研究显示，Nrf2系统的激活被认为是一种有效的细胞保护策略，可用于治疗不同的疾病，例如新型冠状病毒感染[11]。此外，COPD相关的研究显示,Nrf2激活剂CPUY192018通过激活Nrf2，在对抗氧化应激和改善代谢方面显示出显著效果[12]。在经CSE和脂多糖处理的A549细胞中，DJ-1通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路来调节Nrf2介导的MRP1表达和抗氧化防御，以上两项研究可能在COPD的治疗方面提供潜在的靶点和新思路[13]。紫杉醇可能通过刺激Nrf2信号通路来抑制苯并芘所致肺损伤的氧化应激和炎症反应[14]。由此可见，Nrf2的作用在近年来受到了广泛关注，值得进一步的研究与探索。

综上所述，PI3K/Akt信号通路活性及其下游Nrf2蛋白的表达与烟草烟雾暴露的单核细胞炎症反应表达有关，红霉素能够抑制PI3K/Akt通路活性，增加Nrf2蛋白表达，减轻炎症反应，这将为今后的研究及防治工作提供新思路及实验依据。