低温大气压等离子体对脱矿牙本质胶原保护作用的体外研究

贠 宁，王丹杨*，丁 鹏，谢 娜，吴昊宸，李 璇，朱曼琪

（1.西安医学院 口腔医学院 口腔修复学教研室，西安 710021；2.西安医学院 口腔医学院 口腔内科学教研室，西安 710021；3.西安医学院校医院（未央区未央湖医学院社区卫生服务中心），西安 710021）

牙本质是一种结构特殊且成分复杂的牙体硬组织，由具有三维框架结构的牙本质小管和管周、管间牙本质组成，其主要成分为70%无机物、20%有机物和10%水[1]。有机物中约90%为I型胶原蛋白，10%为非胶原蛋白[1]。当牙本质遇到酸性物质引起矿物质大量丢失之后，就会导致胶原纤维网暴露，脱矿的胶原纤维十分敏感，会在细菌代谢产物和基质金属蛋白酶的攻击下发生水解，引发龋病，降低牙本质粘接修复的持久性[2]。

低温常压等离子体（Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma，NTAPP）是近年来一种新兴的表面处理技术，可以产生大量带电粒子、各种离子、自由基和活性氧等活性物质，并且在能量转换时对周围环境的加热作用较弱，因此可保持较低温度，使得等离子体技术可以应用于敏感性较高的生物组织[3]。已有研究证实，等离子体处理可诱导明胶在液态和固态时发生交联，还能够增加胶原纤维表面含氧官能团[4]，有利于保存牙本质胶原纤维的三维形貌。但NTAPP是否是通过增加胶原交联度的方式增韧胶原，尚需研究进一步证实。

本研究拟探讨NTAPP处理脱矿牙本质后，对胶原纤维的交联度及胶原耐降解性的影响，以期为NTAPP在牙酸蚀症、龋病的治疗和牙本质粘接领域的应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

场发射扫描电镜（JSM-7500F，Jeol，日本）、低速金刚石切割机（沈阳科晶自动化设备制造有限公司）、低温常压等离子体发生装置（CTP-2000K，南京苏曼等离子科技有限公司）、示波器（MSO1104Z，苏州普源精电科技有限公司）、冷冻离心机（5804 R，Eppendorf，德国）、全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser-48，上海净信科技）、电子天平（Sartorius，德国）、冷冻干燥机（ES2030，Hitachi，日本）及酶标仪（Thermo Multiskan－GO，美国）。

1.2 主要试剂和材料

茚三酮试剂（鼎国生物试剂有限公司，北京）、磷酸（国药集团，北京，中国）、37%磷酸酸蚀剂（Vericom公司，韩国）、高纯度氦气（99.999%，西安天盛气体有限公司）及去离子水。

收集新鲜无龋的第三磨牙（西安医学院第二附属医院口腔科），患者知情同意，刮除附着软组织，清洗后生理盐水中4℃保存，于1周内使用。本研究由西安医学院伦理委员会审查通过，批准号为XYLS2020142，患者均签署知情同意书。

1.3 胶原交联度测试

1.3.1 NTAPP射流产生

本研究使用的NTAPP设备采用连续正弦波驱动的介质阻挡放电原理，电源输入功率为8 W，峰值电压Vpp为7.0 kV，频率为54.9 kHz，放电气体为高纯度氦气（He），气体流量为3 L/min。

1.3.2 牙本质粉制备

15颗新鲜离体牙用慢速切割机在流水降温条件下，截取冠部牙本质，体式显微镜检查无釉质残留，片切成1 mm厚的牙本质片，液氮中冻存30 min，随后用全自动样品快速研磨仪将牙本质片磨成牙粉（60 Hz，90 s），研磨罐内加有液氮以保持试件在低温下粉碎。牙粉过筛后，选取直径小于20μm的牙粉，用10%的磷酸溶液4℃下浸泡24 h至完全脱矿，无菌去离子水反复冲洗离心牙本质粉5次（3000 rpm/2 min，4℃），最后一次冲洗离心后弃掉上清液（14000rpm/10min，4℃），冷冻干燥备用。实验分为空白对照组、阳性对照组和实验组。空白对照组的牙粉不做任何处理；阳性对照组称取10 mg全脱矿牙粉，用4 mL 5%的戊二醛浸泡120 s，清洗、离心及冻干备用；实验组牙粉置于微孔板中并滴加50μL无菌去离子水混合均匀，NTAPP在8 W 3L条件下处理15 s（2.5 mg/次，n=4次），具体操作步骤如前所述[5]，同样清洗、离心、冻干备用。

1.3.3 交联度测试

每组称量2.5 mg处理后的牙粉做茚三酮染色实验，各组分别加入1 mL无菌去离子水，静置60 min后加入3mL茚三酮试剂（2%茚三酮-无水乙醇溶液），100℃水浴加热20 min，冷却至室温后加入5 mL 60%乙醇溶液，在570 nm波长下用酶标仪测量吸光度，每组设3个平行样本（200μL/样），以平均值作为该组该次样本的测量值。以梯度浓度的甘氨酸溶液绘制标准曲线，依据各组吸光度，对比标准曲线计算自由α-氨基酸的含量。根据公式计算各组交联度[5]。

式中：M0和Mt分别表示交联处理前后牙本质胶原中自由α-氨基酸的量。

1.4 牙本质胶原耐次氯酸钠溶解作用的检测

1.4.1 试件制备

流水冲洗下，11颗新鲜离体牙用慢速切割机去除咬合面釉质层，截取冠部牙本质，每颗牙可制取3片1.5 mm×1.5 mm×6 mm大小的牙本质片，每个牙片背面刻2道刻痕以区分试件正反面。32个试件随机分为阴性对照组和实验组（n=16片）。牙本质表面用37%的磷酸凝胶酸蚀15 s，流水冲洗60 s，对照组试件置于去离子水中备用。无尘纸巾吸干实验组试件表面水分后，置于NTAPP喷嘴下方3 cm处，使射流均匀喷刷牙面15 s。随后各组牙本质片分别浸泡于3.5 mL 5%的NaClO溶液中0、30、60、120 s（n=4片），然后流水下冲洗4 h。

1.4.2 胶原显微形貌观察

将处理后的牙本质试件，用2.5%戊二醛0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）固定4 h，PBS冲洗3次，乙醇梯度脱水，真空干燥、喷金，在场发射扫描电镜（FE-SEM）下观察脱矿牙本质胶原的超微结构。

1.5 数据处理及统计分析

采用SPSS 18.0统计软件，数据符合正态分布，对胶原的交联度进行独立样本t检验，检验水准为0.001。

2 结果

2.1 交联度

各处理组的交联度如图1所示，5%戊二醛处理120 s的交联度为68.17%，NTAPP处理15 s组的交联度稍低于戊二醛组，为65.92%，但2组间无显著性差异（P＞0.001）。

图1 各处理组脱矿胶原交联度（X±s，n=4）

2.2 次氯酸钠溶解后各组胶原纤维形貌

由图2可见，随着NaClO处理时间延长，各组胶原纤维网均出现不同程度降解现象。对照组未经NaClO处理前，牙本质小管间、管周及小管内胶原纤维网完整，如图2（a）所示。经NaClO处理30s后，小管间胶原纤维间隙消失，管内胶原出现断裂现象，部分管周胶原纤维降解，如图2（b）所示。经NaClO处理60s后，胶原纤维降解现象加剧，仅某些小管内可见单根完整的胶原纤维，如图2（c）所示。经NaClO处理120s后，胶原纤维完全降解，牙本质小管口开放呈较大的漏斗状，根管壁可见侧支开口，如图2（d）所示。

NTAPP处理15 s组未经NaClO处理（如图2（e）所示）和经NaClO处理30s（如图2（f）所示），胶原纤维网形貌与对照组未经NaClO处理相似，无明显改变。经Na－ClO处理60s后，管间和部分管周胶原纤维网降解，小管内和部分管周胶原纤维网结构仍较完整，如图2（g）所示。经NaClO处理120s后，胶原纤维进一步降解，未降解的胶原纤维出现断裂和卷曲现象，如图2（h）所示。

图2 NaClO处理不同时间各组胶原纤维FE-SEM图像

3 讨论

本研究证实经过NTAPP处理后，可以增加牙本质胶原的交联度，提高牙本质胶原的耐降解性，其效果与戊二醛处理结果相当。

经NTAPP处理后的具体机制可能与等离子体射流产生的紫外线相关，有研究表明，紫外线辐射可以使明胶链发生交联作用[6]：有学者研究发现紫外线能够打破胶原蛋白的弱内在交联，并产生自由基，其结合光敏剂产生的活性氧可诱导分子间共价键形成分子间交联[7]。

本研究评价了NTAPP处理对提高脱矿牙本质胶原交联度及脱矿牙本质胶原纤维耐NaClO溶液降解的能力。众所周知，戊二醛是一种用于制备植入性生物材料的胶原固定剂，本研究使用NTAPP处理脱矿牙本质胶原后，其交联度与戊二醛处理结果相当，提示NTAPP具有较好的促交联作用。NaClO对蛋白质具有非特异性降解作用[8]。由图1可知，经NTAPP处理后，胶原的降解程度减缓，提示NTAPP处理可改善牙本质胶原纤维的强度。等离子体能够产生多种活性物质，其中的紫外线可引起明胶分子间交联，并在胶原和明胶氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）的芳香残基上形成自由基[6，9]。其次，等离子体产生的自由基可与OH相互作用，在聚合纤维上形成羟基化合物，随后可通过氢键增加交联数量[10]。此外，等离子体中的电子也与基质相互作用，在聚合物链中形成自由基，引发聚合链中瞬间形成自由基，进而启动交联过程[4]。本研究结果正是通过NTAPP增加胶原交联度的作用，提升了胶原的耐降解性。

4 结论

在适宜的条件下，NTAPP处理可有效增加脱矿牙本质胶原的交联度，增强脱矿胶原纤维耐NaClO溶解的能力。本研究中，最适宜的处理时间是15 s。该研究结果为NTAPP在牙酸蚀症、龋病的治疗和牙本质粘接领域的应用提供了新的思路。