白花香莲解毒颗粒治疗HBeAg 阳性慢性乙型肝炎的临床疗效及对血浆外泌体miR-122表达的影响∗

蒙荫杰，邱 华，黄 鹏，李 旺，毛德文

1 广西中医药大学，广西 南宁 530001； 2 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染肝脏后引起的一种慢性传染性疾病。由CHB 导致的相关疾病，如肝硬化、肝癌等，其治疗费用给家庭和社会带来了沉重的负担。miR-122 是肝脏中特异性表达量最多的miRNA，占成年人肝脏中总MicroRNAs（miRNAs）的70%［1］。研究表明，miR-122过表达能够抑制HBV的复制［2］。本课题组前期研究发现，壮药白花香莲解毒颗粒能够抑制HBV-DNA的复制及HBeAg分泌，同时可改善肝功能［3］。为了进一步明确其临床疗效及作用机制，笔者使用随机对照研究方法，观察治疗前后两组临床疗效、乙肝两对半定量、血浆外泌体miR-122、乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）的水平、肝功能并记录不良反应事件，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2018年6月至2019年10月在广西中医药大学第一附属医院肝病科门诊就诊的120例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者，随机分为对照组和观察组，每组60例，同时纳入30例健康体检者作为健康组。观察组中男38例，女22例；平均年龄（37.25±5.81）岁；平均病程（14.18±5.83）年；血清HBV DNA（6.57±0.96）copies/mL；HBeAg滴度为（942.31±527.18）S/Co；血清丙氨酸氨基转移 酶（alanine aminotransferase，ALT）为（107.52±23.46）U/L。对照组中男43例，女17例；平均年龄（38.14±6.32）岁；平均病程（13.52±6.47）年；血清HBV DNA（6.43±0.87）copies/mL，HBeAg 滴 度 为（926.45±516.73）S/Co；ALT 为（102.83±25.31）U/L。两组基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准纳入：1）符合文献［4］中HBeAg阳性慢性乙型肝炎的诊断标准者；2）血清HBeAg、HBsAg均为阳性者；3）年龄18～65岁者；4）本研究经医院伦理委员会批准（伦理编号：AF/SC-08/03.1），且患者签署知情同意书者。

1.3 排除标准排除：1）合并失代偿期肝硬化、肝细胞癌、肝性脑病及其他严重的全身性疾病和精神病者；2）HIV 抗体阳性者；3）合并其他类型肝炎病毒者；4）对恩替卡韦耐药者；5）孕妇及哺乳期妇女；6）近3月内曾参加其他临床试验者。

1.4 治疗方法对照组给予恩替卡韦（正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20100019，批号：18015461）口服，每日0.5 mg，每日1次。共治疗48 周。观察组抗病毒治疗与对照组相同，同时服用白花香莲解毒颗粒（药物组成：白花蛇舌草30 g，三叶香茶菜20 g，黄花倒水莲15 g，排钱草15 g），每日2 次，每次2 袋，早晚饭后温服。两组均治疗48周。

1.5 观察指标于治疗前及治疗12、24、48 周时测定以下指标。

1.5.1 乙肝两对半定量 采用雅培公司的化学发光免疫法检测试剂盒检测乙肝两对半定量。

1.5.2 外泌体miR-122 的测定 采集各组试验者外周静脉血5 mL，标本以3000×g离心10 min，吸取血浆。按照外泌体试剂盒说明书（大连美仑生物技术有限公司）提取外泌体，采用western blot 检测外泌体表面标志性marker CD63、CD9 来对外泌体进行鉴定。提取外泌体后，严格按照Trizol 试剂盒（购自上海名劲生物科技有限公司）说明书操作，采用Trizol 法提取总RNA，并在260、280 nm 波长下检测RNA 溶液的吸光度，若A260/A280为1.8～2.1，可进行下一步实验。配制逆转录反应体系，合成cDNA。PCR 扩增：实验标本均扩增miR-122 及U6 两个基因，以CT 值形式表示RT-PCR检测结果，采用U6作为内参，miR-122的相对表达量以2-ΔCt表示。

1.5.3 HBV DNA 定量 采用荧光定量PCR 法检测血清HBV DNA 载量（试剂盒购自广东凯普生物科技股份有限公司）。

1.5.4 肝功能检测 采用日本奥林巴斯公司的全自动生化仪进行肝功能检测：ALT、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血清总胆红素（total bilirubin，TBiL）、白蛋白（albumin，ALB）水平。因ALT 水平与肝脏病理学显著的炎症坏死和纤维化相关，因此本研究主要观察ALT水平作为肝功能恢复的指标。

1.5.5 安全性指标 观察两组血常规、肾功能、心电图，并记录不良反应事件。

1.5.6 临床疗效［4］显效：ALT、TBiL值恢复正常，HBeAg 血清学转换，HBV-DNA（-）。有效：ALT、TBiL值恢复正常或下降50%以上，HBeAg（-）或HBV-DNA（-），或HBeAb（+）。无效：未达到上述指标者。

1.7 统计学方法应用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理，计量资料以±s 表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBeAg 水平比较治疗12、24、48 周时，观察组HBeAg滴度显著低于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组HBeAg水平、miR-122相对表达量、HBV-DNA及ALT水平比较（±s）

注：与本组治疗前比较，a表示P＜0.05，b表示P＞0.05；与对照组同期比较，c表示P＜0.05，d表示P＞0.05，-表示无数值

组别例数ALT（U/L）107.52±23.46d观察组60 61.72±18.54a，c 41.48±7.52a，c 12.46±3.61a，c 102.83±25.31对照组60 69.47±21.49a 47.85±9.26a健康组18.35±4.68a-30时间治疗前治疗12周治疗24周治疗48周治疗前治疗12周治疗24周治疗48周-HBeAg（S/Co）942.31±527.18d 723.56±228.71a，c 402.13±204.25a，c 184.37±103.54a，c 926.45±516.73 874.43±352.62a 751.26±243.46a 331.28±215.41a-miR-122水平0.51±0.26c，d 2.82±0.74a，c 6.57±1.26a，c 10.62±2.17a，c 0.48±0.24 0.50±0.22b 0.53±0.25b 0.56±0.21b 1.21±0.37 HBV-DNA（copies/mL）6.57±0.96d 4.31±0.24a，c 3.14±0.42a，c 0.84±0.12a，d 6.43±0.87 4.75±0.81a 3.81±0.56a 0.87±0.15a-

2.2 血浆miR-122 相对表达量治疗前，两组血浆中miR-122 的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组与健康组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，在12、24、48 周时，观察组高于治疗前，且同时段比较，观察组均高于对照组（P＜0.05）；对照组治疗12、24、48周时与治疗前比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 血清HBV-DNA 定量及ALT 水平治疗前，两组血清HBV-DNA、ALT水平比较，差异均无统计意义（P＞0.05）；治疗12、24、48周时，上述指标两组较治疗前均有改善（P＜0.05）。两组同时段比较，治疗12、24 周时，观察组HBV-DNA、ALT 水平均低于对照组（P＜0.05）；治疗48周进，两组HBV-DNA比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组ALT 水平比较（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 不良反应治疗后，两组受试者的血常规、肾功能及心电图均未见明显变化，两组均未发生严重不良事件。

2.5 临床疗效治疗48 周时，观察组显效15 例（25.00%），有 效39 例（65.00%），无 效6 例（10.00%），总有效率为90.00%（54/60）；对照组显效7 例（11.67%），有效36 例（60.00%），无效17 例（28.33%），总有效率为71.67%（43/60）。观察组总有效率高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

中医药是我国宝贵的医疗资源，在抗病毒、调节免疫、保肝抗炎等方面具有一定的疗效［5-6］。壮医药因其独特的理论及治则治法为广大人民群众所接受。壮医学认为，毒和虚是引起疾病的重要病因病机［7］，壮医将HBV 病毒归为疫毒，属于“毒邪”范畴，当毒邪感染人体后，留于肝脏，邪正相争，导致龙路、火路拥塞，水道、谷道、气道不通利，毒邪内留日久，耗伤正气，出现五脏六腑功能失调，气血化生不足，而浊毒稽留体内，形成毒虚共存这一病机特点。因此，针对慢性乙型肝炎的病机特点，结合壮乡地处亚热带的气候环境，在“解毒补虚”这一壮医药理论指导下，形成了独具特色的方药——白花香莲解毒颗粒。方中白花蛇舌草为主药，解热毒，除湿毒，通龙路；黄花倒水莲为公药，补虚健脾；三叶香茶菜为母药，清解热毒，辅助主药增强清利湿热、祛邪排毒之功；排钱草作为帮药及引药，具有清热通利水道。诸药相合，具有攻毒补虚，疏通三道，调畅两路，调和阴阳之效。

外泌体（exosome）是体内细胞在多泡小体（MVBs）与细胞质膜融合时释放的胞外囊泡，内含多种蛋白质、mRNA 和miRNA，能够保护miRNA 免受核酸酶的降解［8］，因此外泌体内的miRNA能反映其来源细胞的功能、状态，具有作为生物标志物的价值。miR-122 是肝脏中一种特异的miRNA，约占成年人肝脏中总miRNAs的70%，对于维持肝脏的稳态至关重要［1］。相关研究显示，在人体感染HBV后，肝脏中miR-122的表达水平显著下调，且miR-122的水平与肝内HBV-DNA 载量和肝坏死性炎症呈负相关［9］。进一步研究证实［10］，HBV mRNA 含有一个与miR-122互补的结合位点，两者结合后导致miR-122失活，因此，HBV感染者肝脏的miR-122呈低表达水平。

本研究结果显示，治疗12、24、48 周时，观察组血浆中miR-122 相对表达量均高于治疗前。治疗12、24、48 周时，两组血清中HBV-DNA 水平逐渐下降；观察组在治疗12、24周时HBV-DNA水平低于对照组；治疗48周时，两组HBV-DNA水平相当。可以看出，miR-122 的表达水平增高可以抑制HBVDNA 的复制，即miR-122 的水平与HBV-DNA 载量呈负相关。另外，治疗12、24、48周时，观察组HBeAg滴度显著低于对照组，说明白花香莲解毒颗粒能够有效地抑制HBeAg 的分泌，同时我们发现miR-122与HBeAg的表达可能呈负相关，这与朱蕾等［11］的研究结果一致。

综上所述，miR-122 的表达水平影响着HBV 的复制过程，预示着可以通过提高其表达水平来抑制HBV 的复制。壮药白花香莲解毒颗粒能明显提高miR-122 的表达水平，能够有效地抑制HBV-DNA的复制及HBeAg 的分泌，同时改善肝功能，因此，我们推测，其疗效机制可能与调节血浆外泌体miR-122的表达有关。