葛根素减轻KKAy小鼠血管内皮细胞炎性反应

邹 洁，张德德，陶 毅，赵 静，王 琼，徐乃佳

武汉市中医医院 内分泌科, 湖北 武汉 430050

糖尿病(diabetes)是高血糖为特征的代谢性疾病，发病主要由胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损导致，近年呈现出年轻化发病趋势[1]，该病伴发的肝、肾、血管等疾病严重影响患者的生活质量。葛根素(puerarin,PUR)是提取自豆科植物野葛根中的单一成份黄豆甙元8-C-葡萄糖甙化合物。研究发现[2-3]，葛根素能够扩张血管，改善微循环，抑制炎性反应，降低血管内皮损伤等作用。炎性因子及内皮细胞功能障碍与高血糖之间存在密切联系，本实验通过分析葛根素对KKAy小鼠(2型糖尿病模型小鼠)血管内皮细胞炎性反应的影响，探讨葛根素干预糖尿病血管内皮损伤的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：雄性KKAy小鼠(2型糖尿病模型小鼠)30只(SPF级，10周龄，23～27 g/只)，C57BL/6J健康小鼠[武汉大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2020-0001]。

1.1.2 药品：葛根素(puerarin，PUR)注射液(2 mL：100 mg，百正药业股份有限公司)；盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride，MH)片(0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司)。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)试剂盒(均北京方程生物有限公司)。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)抗体(均上海西唐生物科技有限公司)。TUNEL试剂盒、PCR试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将KKAy小鼠分为糖尿病(diabetes)组(高脂饲料喂养，每天灌胃0.9%氯化钠溶液4.3 mL/kg)、二甲双胍(MH)组(每天灌胃二甲双胍200 mg/kg)及葛根素(PUR)组(每天腹腔注射葛根素注射液1.3 mL/kg)，以C57BL/6J小鼠为对照(control)组，每组各10只。持续干预喂养8周，所有小鼠生活环境及饲养条件一致。

1.2.2 糖代谢指标含量的检测：全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、餐后2 h血糖(2 hBPG)，放免法检测空腹胰岛素(FINS)。

1.2.3 TUNEL法检测血管内皮细胞凋亡：取部分主动脉血管组织放入4%多聚甲醛溶液中浸泡，乙醇脱水后切片。脱蜡后于苏木精中染色，脱水透明后采用TUNEL试剂盒检测血管组织细胞凋亡情况并记录。

1.2.4 ELISA检测血清相关因子变化：ELISA检测血清中TNF-α、IFN-γ、TGF-β1、IL-1和VEGF含量。

1.2.5 RT-qPCR检测VCAM-1和ICAM-1mRNA表达：RNA抽提试剂盒提取血管组织中总RNA量，在反转录试剂盒反转录获取cDNA后设计引物序列，RT-PCR检测血管组织中VCAM-1和ICAM-1 mRNA表达量，采用2-△△Ct计算表达量(表1)。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot检测VCAM-1和ICAM-1蛋白表达：向血管组织中加入RIPA裂解缓冲液后提取总蛋白，BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。蛋白电泳等量分离相关蛋白质，移至PDVF膜上置于4 ℃下添加一抗与β-actin孵育过夜。洗涤后添加二抗，使用ECL试剂进行显影并分析蛋白质相对表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 糖代谢指标比较

糖尿病组FPG、2hBPG、HbAlc含量均高于对照组(P<0.05)，FINS低于对照组(P<0.05)；二甲双胍组与葛根素组FPG、2hBPG、HbAlc含量均低于糖尿病组(P<0.05)，FINS高于糖尿病组(P<0.05)(表2)。

表2 糖代谢指标比较

2.2 血管组织细胞凋亡情况比较

正常细胞核染色为蓝色，发生细胞凋亡时细胞核呈绿色荧光。对照组细胞组织中绿色荧光极少，糖尿病组绿色荧光明显增多；二甲双胍组与葛根素组细胞凋亡趋势减轻，绿色荧光数量明显减少(图1)。

图1 血管组织细胞凋亡情况比较

2.3 血清相关因子比较

糖尿病组TNF-α、IFN-γ、TGF-β1、IL-1、VEGF表达明显高于对照组(P<0.05)； 二甲双胍组与葛根素组TNF-α、IFN-γ、TGF-β1、IL-1、VEGF表达明显降低(表3)。

表3 血清相关指标含量比较

2.4 VCAM-1和ICAM-1 mRNA表达量比较

糖尿病组血管组织中VCAM-1和ICAM-1 mRNA表达升高(P<0.05)。二甲双胍组与葛根素组VCAM-1和ICAM-1 mRNA含量表达降低(P<0.05)(图2)。

MH.metformin hydrochloride; PUR.puerarin; *P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with diabetes group

2.5 VCAM-1和ICAM-1蛋白表达量比较

糖尿病组血管组织中VCAM-1和ICAM-1蛋白表达量明显上升(P<0.05)；二甲双胍组与葛根素组VCAM-1和ICAM-1蛋白表达量明显降低(P<0.05)(图3，表4)。

图3 血管组织中VCAM-1和ICAM-1蛋白表达量比较

表4 血管组织中VCAM-1和ICAM-1蛋白表达量比较

3 讨论

炎性因子在糖尿病的发生发展过程中发挥着重要的作用。大量研究表明[4-6]，机体内环境发生改变时，TNF-α、IFN-γ、TGF-β1及IL-1等炎性因子可以诱导糖尿病血管病变。高血糖刺激时，血管血流动力学会发生改变并引起慢性炎性反应，导致细胞凋亡及炎性细胞浸润增加，促使大量白细胞聚集黏附于血管壁，引起血管内皮病变。VEGF是体内诱导炎性反应的强效因子，它不仅能促进内皮细胞增殖，诱导新生血管生成，还能引发毛细血管渗漏。研究证明，VEGF通过特异性受体作用于血管内皮细胞，从而调控血管内皮细胞增生干预微血管的形成[7]；抑制VEGF表达，可有效降低糖尿病患者血管通透性，改善血管病变[8]。

血管内皮损伤时，细胞表面会释放大量的跨膜糖蛋白参与炎性反应，此类蛋白还能够调控细胞增生功能，介导胞内与胞外基质相互作用，其中最主要的是VCAM-1和ICAM-1[9]。VCAM-1主要由内皮细胞合成并表达于内皮细胞表面[10]。在炎性因子的刺激下，VCAM-1过表达导致白细胞、淋巴细胞、NK细胞等在血管内皮局部聚集，从而引起内皮细胞受损凋亡[11-12]。ICAM-1作为炎性反应的标志物，其参与多种淋巴及粒细胞炎性反应过程，在糖尿病血管病变中发挥着重要作用[13]。高血糖状态刺激下，ICAM-1的过表达会增加血管内皮细胞与白细胞之间的黏附力，促使白细胞在血管内壁积聚，引起毛血管闭塞和新生血管形成[14]。本研究结果发现，葛根素能够明显改善KKAy小鼠血清相关炎性因子变化，减少血管内皮细胞的凋亡，降低VCAM-1和ICAM-1 mRNA及蛋白的表达，这表明葛根素能够有效干预糖尿病小鼠血管内皮损伤。

综上，本研究验证了葛根素降低KKAy小鼠血管内皮损伤的机制，此结果为糖尿病患者血管损伤的后续治疗提供了新的思路。