50份热带睡莲材料的耐寒性评价

迟明宏， 程 哲， 杨志娟， 王彦杰， 金奇江， 杨梅花， 王雪莲， 徐迎春,①

(1. 南京农业大学： a. 园艺学院， b. 三亚研究院， c. 农业农村部花卉生物学与种质创制重点实验室， 江苏 南京 210095；2. 海南大学三亚南繁研究院， 海南 三亚 572025； 3. 石河子大学农学院， 新疆 石河子 832099)

热带睡莲为睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(NymphaeaLinn.)[1]植物中广泛分布于热带地区的类群统称，具有极高观赏价值和生态价值，热带睡莲花色丰富，多应用于园林造景、水生态治理以及日化产品开发等多个领域。然而热带睡莲的适宜生长温度为18 ℃～35 ℃[2]，在北纬24.3°以北地区需要采用保护设施才能安全越冬[3]，生产成本的提高降低了厂商对热带睡莲生产培养的积极性，进而影响了热带睡莲在中国北方的推广和应用。

目前，热带睡莲的研究多集中在育苗技术和杂交育种[4-5]、天然产物提取与功能分析[6-8]以及水体净化[9-11]等方面，已有的耐寒性相关研究存在耐寒程度未量化、耐寒性育种操作技术不成熟[12]等不足。因此，有必要对热带睡莲进行科学的耐寒性评价，确定其安全越冬的温度，为热带睡莲的保护越冬和引种等奠定基础。本研究以50份主栽热带睡莲材料为研究对象，研究低温对叶片生理生化指标的影响，通过半致死温度并结合聚类分析等建立耐寒性评价体系，以期为热带睡莲种质资源区域化引种以及耐寒性种质筛选提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试50份热带睡莲材料均采自南京农业大学龙潭荷花睡莲基地(东经119°08′57″、北纬32°12′06″)，包括埃及白睡莲〔Nymphaealotus(Linn.) Willdenow〕、‘艾利克斯’(‘Alexis’)、‘安妮艾米特’(‘Anne Emmet’)、澳洲IM睡莲(N.immutabilissubsp.immutabilis)、澳洲蓝巨睡莲(N.giganteaHook.)、‘芭芭拉’(‘Barbara Barnette’)、‘白蓝星’(‘White Colorata’)、‘保罗蓝’(‘Paul Stetson’)、‘贝蒂楼’(‘Betty Lou’)、‘查尔斯托马斯’(‘Charles Thomas’)、‘丹泉石’(‘Tanzanite’)、‘蒂娜’(‘Tina’)、‘粉黛’(‘Fen Dai’)、‘粉火烈鸟’(‘Pink Flamingo’)、‘粉钻’(‘Pink Diamond’)、‘盖瑞’(‘Gary’)、‘甘娜’(‘Madame Ganna Walska’)、‘公牛眼’(‘Bull’s Eye’)、‘黑美人’(‘Murasaki Shikibu’)、‘红蟹爪’(‘Nangkwag Red’)、‘狐火’(‘Foxfire’)、‘黄金国’(‘Eidorado’)、‘江南风韵’(‘Southern Charm’)、‘康弘’(‘Yasuhiro’)、‘拉萨米’(‘Rassamee jan’)、‘蓝金神蟹人’(‘Blue Gold Crab Man’)、‘蓝女神’(‘Wood’s Blue Goddess’)、蓝星睡莲(N.colarataPeter)、‘蓝紫苑’(‘Blue Aster’)、‘鲁比’(‘Ruby’)、‘迈阿密玫瑰’(‘Miami Rose’)、‘帕拉米’(‘Paramee’)、‘潘燮’(‘Poonsub’)、‘热带风情’(‘Tropic Punch’)、‘日冕红’(‘Corona Red’)、‘瑞秋’(‘Rachell Presnell’)、‘圣路易斯金’(‘St. Louis Gold’)、‘苏瓦娜’(‘Suwanna’)、‘泰国国王’(‘King of Siam’)、‘泰国之星’(‘Star of Siam’)、‘希拉里’(‘Hilary’)、‘仙馔’(‘Ambrosia’)、小花睡莲(N.micranthaGuill. et Perr.)、‘雪崩’(‘Avalanche’)、‘血色火焰’(‘Scarlet Flame’)、‘伊斯兰达’(‘Islamorada’)、印度红睡莲(N.rubraRoxb. ex Andrews)、‘月光’(‘Moon Beam’)、增殖睡莲(N.proliferaWiersema)和‘紫云’(‘Purple Cloud’)。实验所用的50份株龄相近的材料均由中国科学院植物研究所王竞生研究员鉴定。

1.2 方法

1.2.1 实验处理 于2018年10月，随机从上述各热带睡莲上采集生长状况基本一致、无病虫害的成熟叶片300 g。用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分，并用打孔器在叶片上避开主脉的位置，取直径1 cm的叶块，置于密封袋后放入9610型低温循环仪(美国Polyscience公司)内进行低温处理。根据预实验结果，设定4 ℃、0 ℃、-6 ℃和-12 ℃ 4个温度处理，每个温度梯度间降温1 h，在降至每个低温节点时持续1.5 h。将低温处理后的叶片分成2份，一部分直接用于测定相对电导率，另一部分在室温下解冻后用于测定其他生理生化指标。每个处理设置3次重复。

1.2.2 相对电导率测定以及半致死温度计算 使用DDS-307电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)，并根据文献[12]中的电导法测定相对电导率；通过拟合Logistic方程y=k/(1+ae-bx)计算半致死温度(LT50)，式中，y为细胞伤害率，k为细胞伤害率的饱和容量，x为处理温度，a和b为方程参数[13]。

1.2.3 生理生化指标的测定 采用TBA法[14]测定可溶性糖含量和丙二醛(MDA)含量；采用磺基水杨酸法[15]测定游离脯氨酸含量；采用氮蓝四唑法(NBT)[16]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。上述指标均重复测定3次，结果取平均值。

1.3 数据处理

采用EXCEL 2016软件对实验数据进行处理，并采用SPSS 19.0软件对实验数据进行差异显著性分析、相关性分析和k均值聚类分析。

2 结果和分析

2.1 低温处理对热带睡莲叶片的相对电导率及半致死温度的影响

以不同低温处理下50份热带睡莲材料叶片的相对电导率为参数，带入回归方程求得各个材料的半致死温度(LT50)。获得的回归方程拟合度高，计算出的半致死温度可用于判断不同热带睡莲材料的耐寒性。

结果(表1)显示：随着温度降低，50份热带睡莲材料叶片的相对电导率呈升高的趋势，且在不同低温处理间存在显著差异。从LT50值看，‘江南风韵’的LT50值最低，为-5.85 ℃；‘潘燮’的LT50值最高，为3.69 ℃，跨度达9.54 ℃。LT50值小于等于-5 ℃的热带睡莲有埃及白睡莲、澳洲蓝巨睡莲、‘白蓝星’、‘查尔斯托马斯’、‘盖瑞’、‘甘娜’、‘江南风韵’和‘热带风情’，初步推测这8份材料的耐寒性较佳。LT50值大于0 ℃的热带睡莲有‘丹泉石’、‘粉黛’、‘公牛眼’、‘康弘’、‘迈阿密玫瑰’、‘潘燮’、‘日冕红’、‘泰国之星’、小花睡莲和印度红睡莲10份材料。其余32份热带睡莲材料的LT50值介于-5 ℃～0 ℃范围内。

表1 不同低温处理下50份热带睡莲材料叶片相对电导率及半致死温度(LT50)的比较

2.2 低温处理对热带睡莲耐寒性相关指标的影响

不同低温处理下50份热带睡莲材料叶片的可溶性糖和丙二醛(MDA)含量的比较结果见表2，游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的比较结果见表3。

2.2.1 低温处理对可溶性糖和MDA含量的影响 结果(表2)显示：50份热带睡莲材料叶片的可溶性糖含量为7.56～70.02 mg·g-1。随着温度降低，可溶性糖含量的变化趋势整体可分为3类：第1类为稳定型，各低温处理间的可溶性糖含量差异不显著，包括埃及白睡莲、‘安妮艾米特’、‘芭芭拉’、‘白蓝星’、‘查尔斯托马斯’、‘红蟹爪’、‘狐火’、‘江南风韵’、‘康弘’、‘拉萨米’、‘蓝金神蟹人’、‘热带风情’、‘雪崩’、印度红睡莲和‘月光’15份材料，其中，‘狐火’的可溶性糖含量变幅较小，总体变幅为2.05%～8.22%；第2类各低温处理间的可溶性糖含量存在显著差异，且总体呈先升后降或先降后升的趋势，包括‘艾利克斯’、澳洲IM睡莲、‘保罗蓝’、‘丹泉石’、‘蒂娜’、‘甘娜’、蓝星睡莲、‘蓝紫苑’、‘鲁比’、‘迈阿密玫瑰’、‘帕拉米’、‘潘燮’、‘日冕红’、‘圣路易斯金’、‘苏瓦娜’、‘泰国国王’、‘希拉里’、小花睡莲、‘血色火焰’、‘伊斯兰达’和增殖睡莲21份材料，其中，‘血色火焰’的可溶性糖含量变幅较大，最大变幅为173.81%；第3类各低温处理间的可溶性糖含量存在显著差异，且呈上升或下降或波动变化的趋势，包括澳洲蓝巨睡莲、‘贝蒂楼’、‘粉黛’、‘粉火烈鸟’、‘粉钻’、‘盖瑞’、‘公牛眼’、‘黑美人’、‘黄金国’、‘蓝女神’、‘瑞秋’、‘泰国之星’、‘仙馔’和‘紫云’14份材料，其中，‘盖瑞’的可溶性糖含量变幅较大，最大变幅为67.01%。

表2 不同低温处理下50份热带睡莲材料叶片可溶性糖和丙二醛(MDA)含量的比较

结果(表2)还显示：50份热带睡莲材料叶片的MDA含量为0.28～2.73 mg·g-1。随着温度降低，可溶性糖含量的变化趋势整体可分为3类：第1类为稳定型，各低温处理间的MDA含量差异不显著，包括埃及白睡莲、‘保罗蓝’、‘粉钻’、‘公牛眼’、‘红蟹爪’、‘帕拉米’、‘潘燮’、‘瑞秋’、‘希拉里’和‘血色火焰’10份材料，其中，‘帕拉米’的MDA含量变幅较小，总体变幅为0.0%～13.98%；第2类各低温处理间的MDA含量存在显著差异，且总体呈先升后降或先降后升的趋势，包括澳洲IM睡莲、澳洲蓝巨睡莲、‘芭芭拉’、‘查尔斯托马斯’、‘蒂娜’、‘粉黛’、‘粉火烈鸟’、 ‘甘娜’、‘狐火’、‘黄金国’、‘江南风韵’、‘拉萨米’、‘蓝金神蟹人’、‘蓝女神’、‘蓝紫苑’、‘鲁比’、‘迈阿密玫瑰’、‘热带风情’、‘苏瓦娜’、‘伊斯兰达’、‘月光’和‘紫云’22份材料，其中，‘芭芭拉’的MDA含量变幅较大，最大变幅为160.42%；第3类各低温处理间的MDA含量存在显著差异，且总体呈上升或下降或波动变化的趋势，包括‘艾利克斯’、‘安妮艾米特’、‘白蓝星’、‘贝蒂楼’、‘丹泉石’、‘盖瑞’、‘黑美人’、‘康弘’、蓝星睡莲、‘日冕红’、‘圣路易斯金’、‘泰国国王’、‘泰国之星’、‘仙馔’、小花睡莲、‘雪崩’、印度红睡莲和增殖睡莲18份材料，其中，小花睡莲的MDA含量变幅较大，最大变幅为89.58%。

2.2.2 低温处理对游离脯氨酸含量和SOD活性的影响 结果(表3)显示：多数热带睡莲材料叶片的游离脯氨酸含量在100 μg·g-1上下浮动。随着温度降低，可溶性糖含量的变化趋势整体可分为3类：第1类为稳定型，各低温处理间的游离脯氨酸含量差异不显著，包括埃及白睡莲、‘安妮艾米特’、‘查尔斯托马斯’、‘丹泉石’、‘甘娜’、‘公牛眼’、蓝星睡莲、‘迈阿密玫瑰’、‘瑞秋’和小花睡莲10份材料，其中，‘丹泉石’的游离脯氨酸含量变幅较小，总体变幅为0.68%～3.29%；第2类各低温处理间的游离脯氨酸含量存在显著差异，且呈先升后降或先降后升的趋势，包括澳洲蓝巨睡莲、‘白蓝星’、‘保罗蓝’、‘贝蒂楼’、‘蒂娜’、‘粉火烈鸟’、‘盖瑞’、‘黑美人’、‘狐火’、‘黄金国’、‘康弘’、‘拉萨米’、‘蓝女神’、‘鲁比’、‘潘燮’、‘日冕红’、‘泰国国王’、‘泰国之星’、‘希拉里’、‘仙馔’、‘伊斯兰达’、印度红睡莲、‘月光’、增殖睡莲和‘紫云’25份材料，其中，‘紫云’的游离脯氨酸含量变幅度较大，最大变幅为177.54%；第3类各低温处理间的游离脯氨酸含量存在显著差异，且呈上升或下降或波动变化的趋势，包括‘艾利克斯’、澳洲IM睡莲、‘芭芭拉’、‘粉黛’、‘粉钻’、‘红蟹爪’、‘江南风韵’、‘蓝金神蟹人’、‘蓝紫苑’、‘帕拉米’、‘热带风情’、‘圣路易斯金’、‘苏瓦娜’、‘雪崩’和‘血色火焰’15种，其中，‘雪崩’的游离脯氨酸含量变幅度较大，最大变幅为109.92%。

结果(表3)还显示：50份热带睡莲材料的SOD活性差异不大，数值较为集中。随着温度降低，可溶性糖含量的变化趋势整体可分为3类：第1类为稳定型，各低温处理间的SOD活性差异不显著，包括‘艾利克斯’、澳洲IM睡莲、澳洲蓝巨睡莲、‘粉黛’、‘盖瑞’、‘甘娜’、‘公牛眼’、‘红蟹爪’、蓝星睡莲、‘帕拉米’、‘希拉里’、‘血色火焰’和‘月光’13份材料，其中，‘月光’的SOD活性变幅较小，总体变幅为0.34%～5.47%；第2类各低温处理间的SOD活性存在显著差异，且呈先升后降或先降后的趋势，包括埃及白睡莲、‘安妮艾米特’、‘芭芭拉’、‘白蓝星’、‘保罗蓝’、‘贝蒂楼’、‘查尔斯托马斯’、‘蒂娜’、‘粉火烈鸟’、‘粉钻’、‘康弘’、‘拉萨米’、‘蓝女神’、‘蓝紫苑’、‘迈阿密玫瑰’、‘潘燮’、‘热带风情’、‘日冕红’、‘瑞秋’、‘圣路易斯金’、‘泰国国王’、‘伊斯兰达’、增殖睡莲和‘紫云’24份材料，其中，‘蓝紫苑’的SOD活性变幅度较大，最大变幅为61.76%；第3类各低温处理间的SOD活性存在显著差异，且呈上升或下降或波动变化的趋势，包括‘丹泉石’、‘黑美人’、‘狐火’、‘黄金国’、‘江南风韵’、‘蓝金神蟹人’、‘鲁比’、‘苏瓦娜’、‘泰国之星’、‘仙馔’、小花睡莲、‘雪崩’和印度红睡莲13份材料，其中，‘黑美人’的SOD活性变幅度较大，最大变幅为24.80%。

表3 不同低温处理下50份热带睡莲材料叶片游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的比较

2.3 相关性分析

基于50份热带睡莲材料的半致死温度(LT50)在3.69 ℃～-5.85 ℃范围内，选取4 ℃、0 ℃和-6 ℃低温处理下各生理生化指标的均值进行相关性分析，结果见表4。结果显示：热带睡莲材料的LT50值与可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸含量呈极显著正相关，与超氧化物歧化酶(SOD)活性呈极显著负相关，相关系数分别为0.460、0.578、0.395和-0.440。MDA含量与可溶性糖含量呈极显著正相关，与游离脯氨酸含量呈显著正相关，相关系数分别为0.468和0.350。表明热带睡莲会通过多种生理生化反应来应对低温胁迫，且部分生理生化指标间存在显著关联性。

表4 低温处理下50份热带睡莲材料生理生化指标间的相关系数1)

2.4 聚类分析

半致死温度(LT50)是衡量植物耐寒性的重要依据，因此选LT50值作为重要筛选因子，同时为避免产生大的误差，选用与LT50值的相关系数绝对值大于0.4的指标〔可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性〕作为k均值聚类分析的依据，结果(表5)显示：50份材料聚为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4类。

表5 基于生理生化指标的50份热带睡莲材料的k均值聚类分析

Ⅰ类为不耐寒型，包括‘公牛眼’、‘康弘’、‘蓝女神’、‘迈阿密玫瑰’、‘潘燮’、‘圣路易斯金’、‘苏瓦娜’和印度红睡莲8份材料。LT50值大多高于0 ℃，均值为1.05 ℃；可溶性糖含量的均值最大，MDA含量的均值较大，SOD活性的均值最小。

Ⅱ类为弱耐寒型，包括‘艾利克斯’、‘安妮艾米特’、‘芭芭拉’、‘丹泉石’、‘蒂娜’、‘粉黛’、‘粉红烈鸟’、‘狐火’、‘泰国之星’、‘仙馔’、小花睡莲和‘雪崩’12份材料。LT50值在-3.74 ℃～3.02 ℃之间，均值为-0.69 ℃，除‘丹泉石’、‘粉黛’和‘泰国之星’外，该类其他材料的LT50值均低于0 ℃；可溶性糖含量的均值较大，MDA含量的均值最大，SOD活性的均值较小。

Ⅲ类为中等耐寒型，包括澳洲IM睡莲、澳洲蓝巨睡莲、‘白蓝星’、‘保罗蓝’、‘贝蒂楼’、‘查尔斯托马斯’、‘粉钻’、‘红蟹爪’、‘黄金国’、‘拉萨米’、‘蓝金神蟹人’、蓝星睡莲、‘鲁比’、‘帕拉米’、‘热带风情’、‘日冕红’、‘瑞秋’、‘泰国国王’和‘月光’19份材料。LT50均值为-3.16 ℃，仅‘日冕红’的LT50值高于0 ℃，该类其他材料的LT50值大多低于-2 ℃；可溶性糖和MDA含量的均值较小，SOD活性的均值较大。

Ⅳ类为强耐寒型，包括埃及白睡莲、‘盖瑞’、‘甘娜’、‘黑美人’、‘江南风韵’、‘蓝紫苑’、‘希拉里’、‘血色火焰’、‘伊斯兰达’、增殖睡莲和‘紫云’11份材料；LT50值在-5.85 ℃～-1.77 ℃之间，均值为-3.94 ℃；可溶性糖和MDA含量的均值较小，SOD活性的均值最大。

总体上看，耐寒性越强的材料的可溶性糖和MDA含量越低，SOD活性越高。

3 讨论和结论

传统的植物耐寒性测定方法通常将半致死温度或某种单一指标作为评价依据[17-18]，例如在葡萄(VitisviniferaLinn.)[19]、杜鹃花(RhododendronsimsiiPlanch.)[20]和鸢尾(IristectorumMaxim.)[21]的耐寒性比较研究中均利用电解质外渗法测定半致死温度，证明半致死温度均值作为植物耐寒性基本指标具有可靠性[22]。然而，尽管半致死温度可以在一定程度上反映植物抗寒性，但植物抗寒能力是植物体内多物质参与抗逆反应的综合作用的结果[23]，并不由单一因子决定[24]，植物的耐寒性也会受到其他因子影响。相关实验结果表明：可溶性糖含量[25]、丙二醛(MDA)含量[26]、超氧化物歧化酶(SOD)活性[27]均与植物的抗寒性密切相关[28]。本研究结果显示：‘查尔斯托马斯’按照其半致死温度-5.36 ℃来判断应属于耐寒性较强的材料，然而其SOD活性在低温胁迫中表现出显著下降的趋势，最大降幅达到31.62%，可能是由于细胞中的功能蛋白受到低温破坏，在低温环境中调节能力较弱，无法适应低温环境[29]。同样，‘希拉里’半致死温度为-1.77 ℃，初步判断其耐寒性一般，然而其MDA含量在-12 ℃～4 ℃低温胁迫中无显著差异，说明其细胞质膜受到低温胁迫损害较小，在低温下可继续发挥活性氧清除系统的作用，能较好地适应低温环境[30-31]。

相关性分析结果显示：热带睡莲材料的MDA含量与可溶性糖含量呈极显著正相关。二者都通过细胞渗透调节[32]与酶活性[33]参与低温胁迫反应。从整体变化趋势看，随着温度从4 ℃降低到-12 ℃，在实验初期阶段，各材料为了应对低温胁迫，选择水解更多淀粉提高细胞的渗透压[34]，同时低温使活性氧清除系统的酶活性降低，导致材料在该阶段逐渐积累了大量的MDA和可溶性糖；在实验后期由于胁迫加剧，植物细胞膜因结构遭到破坏而透性丧失，无法维持细胞正常生理功能[35]，导致该阶段材料的MDA和可溶性糖含量下降或产生波动；有些耐寒性较差的材料，在实验初期4 ℃时细胞结构就遭到严重低温破坏[36]，其MDA或可溶性糖含量在实验初期剧增至顶峰，后呈持续下降趋势，如‘蓝女神’和‘泰国之星’等。而耐寒性较强的材料，水解反应相对稳定，细胞维持原有的代谢机制便可以应对胁迫，在整个降温过程中MDA和可溶性糖含量均无显著变化，如埃及白睡莲和‘红蟹爪’等。说明耐寒性较强的材料的MDA和可溶性糖含量大多处于较低水平。

通过比较半致死温度可以得出热带睡莲材料的耐寒性，但结果带有局限性，无法实现更系统、更科学的分级。为了克服单一指标的缺陷，进一步指导热带睡莲的生产推广，本研究在前人研究的基础上[37-38]，采用相关性分析筛选出与半致死温度关联度较高的3个指标，即可溶性糖含量、MDA含量和SOD活性，基于上述4个生理生化指标进行k均值聚类分析，建立的评价体系能更全面地反映植物的真实抗寒能力。本研究结果显示：50份热带睡莲材料可分为不耐寒型、弱耐寒型、中等耐寒型和强耐寒型4类，总体上看，耐寒性越强的材料的可溶性糖和MDA含量越低，SOD活性越高。其中，埃及白睡莲表现出强耐寒性，‘狐火’表现为弱耐寒性，这一结论与吉琴[39]的研究结果相似。依据研究测定的半致死温度及评价体系，结合中国气候地理相关研究，可为不同地区引种耐寒性的热带睡莲提供参考。

此外，由于本文研究的是50份热带睡莲离体叶片在人工低温处理下的生理生化反应，与整个植株在自然低温下的生理生化反应有一定的差距，并且没有对低温下发生的生理生化反应进行全面研究，不能代替复杂自然条件下的低温情况。因此，热带睡莲种质资源在全国范围内的引种栽培应根据当地的养护条件以及田间种植试验数据，调整不同热带睡莲的养护措施，具体还有待后续的深入研究。