循环肿瘤细胞在早期肺癌诊断及预后的研究进展*

龚 臣 综述,闫 萍 审校

广西医科大学第一附属医院老年病学呼吸内科,广西南宁 530021

肺癌是男性最常见的癌症,女性肺癌发病率仅次于乳腺癌,乳腺癌每年估计有230万新病例(11.7%),其次是肺癌(11.4%)、结直肠癌(10.0%)、前列腺癌(7.3%)和胃癌(5.6%)。肺癌是包括中国在内的许多国家的肿瘤死亡首要原因,每年估计有180万人死亡(18%)[1]。肺癌可分为两个主要的细胞学亚群:小细胞肺癌(SCLC)占20%,非小细胞肺癌(NSCLC)占80%。NSCLC进一步细分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。由于约70%的肺癌患者确诊时已是晚期,不能行手术治疗,化疗、放疗和靶向治疗是最常见的治疗选择,但5年生存率较低。对于少数早期NSCLC患者,手术治疗是最常见的治疗选择,然而仍有肿瘤复发转移,总体存活率仍然很低。

诊断肺癌的阶段对预后有重大影响。然而,肺癌的及时检测较为困难,因为患者在早期通常没有症状。低剂量计算机断层扫描(LDCT)是目前最广泛推荐的肺癌筛查方法,但它会带来辐射风险,并且单一的LDCT检查,在临床实践中,区分孤立性肺结节良恶性仍然是一个挑战。早期肿瘤已经出现潜在转移是导致较低存活率的一个重要因素,且选择性治疗往往基于单个肿瘤活组织表型和分子检查,这可能低估了肿瘤异质性,而没有考虑肿瘤进化和治疗抵抗的能力[2]。肺癌的监测对治疗的成功至关重要,然而复发的活组织检查通常较困难。因此,能够识别早期出现的治疗耐药性并发现新的驱动突变的微创方法对于优化肺癌治疗至关重要。这种微创方法被统称为“液体活检”,它利用的是肿瘤可以将细胞和分子成分转移到血液中,在那里它们可以被识别为循环肿瘤细胞(CTCs)和循环游离核酸(cfNAs)。尽管在肺癌中,cfNAs的检测已经取得了相当大的进展,尤其是循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测,CTCs是循环系统外渗的肿瘤,是转移的前体,因此,它们是包括微转移在内的癌症监测的理想目标[3-4]。CTCs仍然是研究肿瘤生物学的重要手段,因为它们可以用于建立体内和体外模型,用于测试新药或药物组合,并识别可能的耐药机制[5]。

CTCs的分子和遗传特性研究是一个相对较新的领域,在这一过程中逐渐向临床转化。肺癌若在早期发现并干预,将直接影响患者的预后,本篇综述将着重介绍CTCs在指导肺癌早期筛查、治疗预后评估、随访过程中的应用。

1 CTCs作为早期肺癌检测的生物标志物

由于原发肿瘤在其整个发展过程中,甚至在肿瘤发展的早期阶段CTCs就能游离出原发组织[6],因此,检测CTCs可能为早期癌症检测提供一种灵敏的方法。早期发现对肺癌患者尤其有益,因为肺癌患者大部分确诊时已是晚期,治疗局限,且效果差。有研究表明,在168例慢性阻塞性肺疾病患者中,有5例患者检测到CTCs,预测到随访后的1～4年内会出现肺小结节[7]。最近,一项研究评估了CTCs的存在,以区分良恶性肺部病变[8]。恶性病变患者中有90%检测到CTCs,良性病变患者中有5%检测到CTCs。HASHIMOTO等[9]也发现,给予Ⅰ期的NSCLC 患者术前进行CTCs检测,发现17例患者检测到CTCs,其中2例病理结果证实为肺内转移灶,对另外15例患者进行长期随访发现,术前CTCs阳性与术后复发相关。

血液中的CTCs可作为有效筛查和诊断的标志物,以区分小的恶性肺结节和良性病变。有学者对直径小于30 mm的肺结节患者进行研究,分析CTCs、CT检查特征、血清肿瘤标志物浓度及组织病理学特征,发现良恶性肺结节患者的CTCs有明显差异,联合使用CTCs和CT确定的结节密度特征进一步提高了恶性肺结节的诊断效果,以及TNM分期的确定[10]。循环基因异常细胞(CACs)也可以用来鉴别肺癌和良性肺部病变。使用LDCT进行肺癌筛查在肺结节≤10 mm的患者中特异度较低,国内一项多中心前瞻性研究表明,当CACs的最佳临界值为2时,肺癌的灵敏度和特异度分别为70.5%和86.4%。提示CACs对肺结节≤10 mm有较好的肺癌诊断价值[11]。

MANJUNATH等[12]研究发现,在所有NSCLC 患者中检测到CTCs。在肿瘤诊断方面,目前肿瘤早期筛查主要依靠血清肿瘤标志物和CT检查;传统检测需要病灶形态提示高度恶性才考虑切除。CTCs从原发性或转移性肿瘤脱落后在外周血中循环,因此检测不依赖于肿瘤负荷,从而使CTCs具有更高的灵敏度和特异度。CTCs在原发性肺癌诊断中的阳性检出率高于血清肿瘤生物标志物。CTCs是疾病状态的可靠指标,可作为诊断NSCLC有利的生物学标志物。使用新的配体靶向PCR检测技术,研究了CTCs区分NSCLC与肺部良性疾病的诊断价值,检测到的CTCs的分子表型可用于区分肿瘤类型。叶酸受体阳性CTCs在肺癌诊断中显示出较高的诊断效力[13]。叶酸受体阳性CTCs与其他肿瘤生物标志物的组合可以明显提高区分肺癌和肺部良性疾病的诊断效能[14]。

因此,液体活检作为一种非侵入性检测方式,操作简单。CTCs可能是肺癌早期检测的有效标志物,通过检测CTCs来早期诊断癌症十分必要。然而,早期肺癌检测由于所涉及的CTCs数量较少,且可能有较高的假阴性,因此,在早期肺癌检测中使用CTCs的可行性需要一个大型的、多中心的试验。

2 CTCs作为预后生物标志物

CTCs在临床上作为预后标志物的应用前景广阔。液体活检作为监测肿瘤遗传学和肿瘤动力学的新方法引起了肿瘤学的极大兴趣,被证明是检测与肿瘤复发明显相关的微小残留病的重要工具。使用液体活检检测外周血中的肿瘤成分,如血浆中的CTCs和ctDNA,已被证明是监测实时肿瘤基因组变化的微创工具[15]和对治疗的反应,以及调查耐药性和评估可手术早期癌症的肿瘤复发风险,最终将液体活检整合到临床工作流程中[16]。美国食品药品监督管理局已经批准了几种单基因检测和多基因检测,以检测浆细胞游离DNA的遗传改变,用于与特定分子靶向癌症治疗相匹配的伴随诊断[17]。这些批准标志着液体活检在临床上广泛应用的一个转折点。

癌症驱动基因突变状态和表达特征等分子改变与早期肺癌预后有关。TNM 分期目前仍然是肺癌中使用最广泛的预后工具。然而,分期组内生存的变异性表明有必要寻找额外的预后参数。与此同时,越来越多的证据支持表观遗传改变的预后价值,但基因突变与早期肺癌的预后研究鲜有报道。研究者分析了73例早期肺腺癌患者的分子谱,对表皮生长因子受体(EGFR)和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)进行突变分析。在5.47%的患者中发现了EGFR突变,仅检测到外显子19缺失;9.58%的患者中存在KRAS突变,而只有1例患者为间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性;此外,在56.16%的患者中检测到p53的异常免疫染色[18]。总之,EGFR和KRAS突变和ALK重排的检出率低于欧洲和亚洲国家,而p53异常表达的发生率略高。此外,鉴于该研究的样本量较小,有必要对该患者进行更全面的分析[18]。因此,早期肺癌亦存在基因突变,其预后价值来自欧洲早期肺癌生物库的NSCLC标本研究,以评估TP53、KRAS和EGFR基因突变的预后意义[19]。该研究包括11例从不吸烟者、86例既往吸烟者、152例现吸烟者和1例不详吸烟状况的患者;鳞癌110例,腺癌133例,大细胞癌或混合组织7例;该研究发现从冰冻的肿瘤组织中提取DNA,突变率为48.8%,TP53突变状态与预后无关;EGFR基因突变几乎只在从不吸烟的女性中发现;KRAS基因突变在18.5%的患者中检出,且与疾病进展有关。这些结果表明,突变是不同病因和组织病理形式肺癌的良好标志物,但除了KRAS突变外,几乎没有预后价值,KRAS突变可能对腺癌有预后价值[19]。CTCs有望作为监测NSCLC患者预后和复发的生物标志物。在100例NSCLC手术切除患者中,48%的患者检测到了肺静脉循环肿瘤细胞(PV-CTC),PV-CTC、基因组分析和计数有可能成为 NSCLC 复发的早期预测指标[20]。在患者纵向监测血液循环中的 CTCs 比放射学证据更能指示疾病复发[21]。CTCs 的分子特征可以提供基于细胞计数的有用信息。不同转移潜能患者的 CTCs 具有特定的基因特征和不同的表达谱,可用于识别早期 NSCLC 患者的高复发风险[22]。

手术仍然是早期肺癌患者的最佳治疗策略,但这种手术干预后的评估和预警机制不够健全。 CTCs检测和血浆代谢物分析可能是诊断早期肺癌和识别有疾病复发风险的患者的有效手段[23]。CTCs检测可以识别出那些具有较高疾病复发风险的肺癌患者,从而有可能让临床医生确定哪些患者最有可能从手术后的辅助治疗中获益。一项回顾性研究表明,术前CTCs水平是NSCLC患者预后的独立、灵敏的生物标志物[24]。基于术前CTCs水平在预测NSCLC患者术后转移和复发风险中具有重要价值,CTCs是晚期NSCLC患者无进展生存期和总生存期的独立预后指标,当CTCs计数添加到完整的临床病理预测模型时,可以改善预后[25]。CTCs的检测与早期和晚期NSCLC患者的不良临床结局相关。转移是NSCLC患者死亡的主要原因。然而,鉴别术后局部或远处转移的NSCLC患者仍然具有挑战性。CTCs能准确反映循环血液中肿瘤细胞微转移对患者治疗及预后的影响。

早期肺癌治疗后随访复查CTCs对预测患者预后复发起关键作用。一项荟萃分析评估早期NSCLC液体活检的诊断和预后价值[26],包括常见生物标志物、CTCs、ctDNA、甲基化标志物和microRNAs。结果提示生物标志物对早期NSCLC的估计诊断价值在0.84～0.87。TNM Ⅰ期、T1期、N0期、腺癌、年轻和不吸烟等因素有助于降低肿瘤负担,中位细胞游离DNA水平为8.64 ng/mL。对于预后分析,微小残留病检测的存在是疾病复发的一个强有力的预测因子,从分子层面预测复发到影像学监测到疾病进展的间隔时间为(179±74)d。因而,在临床工作中,如果在早期肺癌随访过程中行液体活检,可以提前约半年发现肺癌复发进展。

程序性死亡配体1(PD-L1)表达阳性的CTCs与早期肺癌不良结局相关。目前多项研究表明,CTCs与接受免疫检测点抑制剂治疗的NSCLC预后有关[27-29]。外周血CTCs表面含有PD-L1蛋白的表达,从肺癌的早期阶段分离出的CTCs预示着预后不良,并且可以通过定期随访来确定预测复发的生物标志物[30],但该研究仅包括36例肺癌患者,并且患者的分期并不都是早期(Ⅰ期患者仅19例)。另外一项扩大样本研究表明,对110例可手术的肺癌患者通过肺静脉检测CTCs,其中仅4例未发现CTCs[31],根据患者肺静脉CTCs是否表达PD-L1,将患者分为PD-L1阳性CTCs组(56/110,50.1%)和PD-L1阴性CTCs组(54/110,49.9%);单变量分析显示PD-L1阳性CTCs组患者的中位无病生存期缩短,PD-L1阳性CTCs组的中位无病生存期为 16.7个月,PD-L1阴性CTCs组中位无病生存期为24.5个月,因而,CTCs中PD-L1的检测可能为术后辅助免疫治疗提供重要决策。

CTCs在肺癌放疗预后中亦发挥着重要作用。对于早期NSCLC患者行立体定向放射(SBRT)治疗后,监测CTCs可能会提前预警疾病复发或进展,治疗后CTC计数阴性可能会为疾病控制提供保证[32]。CTCs分析可能有助于加强该人群的临床诊断和随访。SBRT早期NSCLC 10%～15%的患者会局部失败,20%～25%的患者会出现远处失败。SBRT治疗Ⅰ期的NSCLC患者在治疗前、治疗期间和治疗后24个月内连续采集标本。结果发现治疗前,较高的CTCs和治疗后CTCs的持续存在与靶向治疗部位以外复发风险增加相关[33]。这表明CTCs分析可能会潜在地识别区域或远处复发风险较高的患者,以及可能从全身治疗或及时的局部区域补救治疗中获益。CTCs检测可作为SBRT后复发风险增加的预后标志物。

综上所述,CTCs作为液体活检在肺癌早期检测、预后的临床价值较高。肺癌重在早诊早治,若在影像学表现之前和手术干预后进行CTCs随访检测,对肺癌早期诊断及预后复发进展起着非常重要的作用。