澜沧江真核浮游生物的空间格局及其多样性

胡愈炘，金 磊，刘 威，谭庆军，梅增荣，胡 圣，王英才，熊少凯，邓 玥

(1.生态环境部长江流域生态环境监督管理局 生态环境监测与科学研究中心，武汉 430010； 2.华能澜沧江水电股份有限公司，昆明 650214； 3.云南启迪实业发展有限公司，昆明 650214)

1 研究背景

澜沧江，境外称为湄公河，是发源于青海唐古拉山北麓查加日玛，流经中国、缅甸、老挝、泰国、柬埔寨和越南的国际大河，其水资源、水能资源极其丰富，战略地位重要[1]。澜沧江在我国境内河长2 161 km，流域面积16万多km2[2]。近年来澜沧江干流梯级电站的开发形成了梯级库群，导致河流水文情势发生改变[3]，河流生态连续性的改变导致生态环境改变，对澜沧江浮游生物的群落组成和空间分布产生了较大影响[4-5]。

浮游生物是水体中营浮游生活的微小生物，在能量流动和物质循环中起重要作用，其多样性和群落特征能够反映生态环境优劣[6]。浮游生物分为原核和真核两类，其中原核浮游生物包括细菌、蓝藻和放线菌等。程豹等[5]基于16S rRNA高通量测序技术探究了澜沧江流域浮游细菌的群落结构特征，发现自然河道段和水库段浮游细菌多样性和驱动因子存在显著差异。真核浮游生物主要包括浮游植物和浮游动物，浮游植物的群落结构组成对环境具较强指示作用[7]，浮游动物在水域生态系统的物质转化、能量流动、信息传递过程中发挥着重要作用[8]。目前澜沧江真核浮游生物群落研究主要集中于浮游植物，例如孙胜浩等[9]研究了澜沧江硅藻的地理分布模式，结果发现硅藻的分布存在显著的空间差异；朱海涛等[10]利用浮游植物群落结构数据对澜沧江进行水质评价，数据显示澜沧江源区水生态状况整体优良；殷大聪等[11]对澜沧江源区浮游植物进行调查和分析，据此发现江源地区水环境状况较好。

本研究基于18S rRNA宏条形码技术研究澜沧江真核浮游生物多样性和群落结构变化，该技术能够深入挖掘真核浮游生物的多样性[12]，以充分探讨空间差异下不同真核浮游生物群落结构与环境因子的相关性，以期为澜沧江生态环境保护提供参考依据。

2 材料方法

2.1 研究区域与样品采集

2020年10月在澜沧江进行样品采集，共布设了36个样点，采样区域涵盖澜沧江自源区至下游近2 000 km的范围，样点布设如图1所示。

图1 澜沧江样点分布Fig.1 Location of sampling sites in the Lancang River

对于环境DNA样品，采用高压灭菌处理后的采水器采集1.5 L表层水样，使用0.2 μm聚碳酸酯滤膜(Whatman)真空抽滤，每次抽滤前使用次氯酸钠对抽滤装置进行浸泡消毒，洗净后进行抽滤。抽滤后将滤膜装于液氮中运输至实验室，使用DNA提取试剂盒(Mobio)提取DNA，在液氮中保存DNA。

对于水质样品，利用YSI多参数水质测量仪(Xylem)现场测量每个样点的水温、pH值、溶解氧(DO)、电导率(EC)等水质指标。水体总磷(TP)、总氮(TN)、硝酸盐(NO3-N)等环境因子的测定参照《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)。碱度(A)的测定参照《碱度(总碱度、重碳酸盐和碳酸盐)的测定》(SL 83—1994)。

2.2 高通量测序及生物信息学分析

采用引物5’-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3’和5’-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3’进行18S rRNA V4区扩增[13]。PCR采用20 μL反应体系，包括4 μL的5×FastPfu Buffer(反应缓冲液)、2 μL的2.5 mM dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、正向和反向引物各0.8、0.4 μL的FastPfu Polymerase(聚合酶)、0.2 μL的BSA(牛血清白蛋白溶液)溶液、10 ng的DNA模板，然后使用ddH2O(双蒸水)补足至20 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s(25个循环)；最后72 ℃延伸10 min。每个样品进行3次PCR技术重复，以无菌水作为阴性对照，阴性对照无可见扩增，将3份产物混合后采用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱后，再用2%琼脂糖电泳检测。使用Miseq建库试剂盒(TruSeqTM DNA Sample Prep Kit)进行文库的构建，库检合格后使用MiSeq PE300平台(Illumina)进行上机测序。

测序得到的下机数据使用FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)进行质控，使用Cutadapt v1.17软件去除接头序列[14]，使用USEARCH v11.0.667软件进行双端序列拼接[15]，基于QIIME软件在97%的相似水平下进行OTU(Operational Taxonomy Unit)的聚类，通过朴素贝叶斯分类器将OTU序列比对至Silva数据库(Release138 http：//www.arb-silva.de)进行OTU注释[16]。α多样性、空间差异分析及RDA(Redundancy Analysis)分析等使用R语言中的vegan包计算[17]。

3 结果与讨论

3.1 测序结果

使用Miseq高通量平台对36个样品进行测序，获得的原始序列数目为49 955～74 777条，平均为67 693条；各样品原始序列长度为368～382 bp，平均为376 bp。基于97%的相似度一共获取了1 269个OTU，涵盖45门284属。OTU聚类情况如图2(a)所示，聚类出的OTU数目为104～593个，其中L2点位聚类出的OTU数量最少(104个)，L10点位聚类出的OTU数量最多(593个)。聚类出OTU数量>400的点位主要位于L6—L14区域，而OTU数量<400的点位则在整个澜沧江均有分布。

从每个样本中随机抽取序列，统计每次随机抽取序列中包含的OTU数量(OTU的数量即种类数，代表着物种丰富度)，据此构建稀释性曲线，结果如图2(b)所示。图2(b)中每一条曲线代表一个样本，随着随机抽取序列数的增加，每个样本统计得到的OTU数量逐渐增加。当随机抽取序列数目在40 000条以上时，样本统计得到的OTU数量不再显著增加，意味着更多的数据量只会产生少量新的OTU，说明本次测序深度合理[18]，能够覆盖绝大多数的多样性。

图2 各样点OTU注释结果Fig.2 OTU annotation results of sampling sites

3.2 真核浮游生物群落的空间差异分析

真核浮游生物群落各样点的空间差异分析见图3。基于β多样性分析澜沧江真核浮游生物的空间差异，非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)结果如图3(a)所示，其中每个点代表一个样本，各点距离越近，差异越小。L1—L10样本形成一个分组，L11—L23样本形成一个分组，L24—L36样本形成一个分组。NMDS平均胁强系数(Stress)为0.092 7，在0.05和0.1之间，表明结果可信[19]。L1—L10位于澜沧江上游，该区域为自然河道段，平均水温为4 ℃，平均流速为0.33 m/s；L11—L23位于澜沧江中游，该区域处于乌弄龙电站和功果桥电站之间，平均水温为14 ℃，62.5%的点位显示平均流速为0.41 m/s，37.5%的点位水面平静导致流速无法测量；L24—L36位于澜沧江下游，包括了功果桥电站及以下区域，平均水温为20 ℃，现场监测结果显示下游所有点位均流速过缓，低于检出下限，其水体流速相对中游明显更缓；3个区域在水体自然状态上有明显区别，较好地体现了真核浮游生物群落在上、中和下游的空间差异。

图3 各样点的空间差异分析Fig.3 Spatial differences of sampling sites

基于相似性分析(analysis of similarities，ANOSIM)验证分组结果的统计显著性，如图3(b)所示。其中“组间”代表组间样品的两两差异，其他3组代表各组组内两两差异的波动范围。结果显示组间差异大于组内差异，中游区域的样本间异质性相对较大。总体分组R2=0.683>0，P=0.001<0.05，说明不同分组间差异显著。

根据分组信息统计各组得到的OTU种类如图3(c)所示。上游特有OTU占比14%，共有OTU占比61%；中游特有OTU占比3%，共有OTU占比57%；下游特有OTU占比8%，共有OTU占比64%；上、中、下游共有OTU占比更多而特有OTU占比较少。由此可见，特有物种造成的差异不是澜沧江上、中、下游分组的根源，因此需进一步开展多样性和群落组成分析。

3.3 澜沧江真核浮游生物群落不同空间的α多样性

基于α多样性分析澜沧江真核浮游生物群落在上、中、下游的差异。Shannon-Wiener指数能够反映生物群落整体的多样性，Pielou均匀度指数能够反映群落组成的均匀程度[20]，Chao1指数能够反映群落中的丰富度[21]，各分组3个指数的结果如图4所示，其中***表示P≤0.001，**表示P≤0.01，NS表示差异不显著。

图4 澜沧江真核浮游生物群落的α多样性Fig.4 The α diversity of eukaryotic plankton community in the Lancang River

上游的Shannon-Wiener指数和Pielou均匀度指数均显著高于中下游，但三者的Chao1指数无显著差异，说明3个区域物种丰富度无显著差异，但上游浮游生物组成最为均匀，因此具有最高的多样性；中游和下游的Shannon-Wiener指数、Pielou均匀度指数和Chao1指数均不具显著差异，说明两个区域的浮游生物多样性状况类似。由于澜沧江干流梯级电站的位置主要分布于中下游，电站的开发改变了河流自然生态系统状况，因此不仅可能造成中游和下游两个区域浮游生物多样性的类似，也可能造成中下游浮游生物多样性与上游多样性的差异。

3.4 澜沧江真核浮游生物群落的空间分布

为探究真核浮游生物群落在澜沧江各区域的空间分布情况，在门的分类学水平上基于热图展示了各类群在各样点的相对丰度情况，结果如图5(a)所示；参照Levins生态位宽度的概念计算各类群的生态位宽度[22]，结果如图5(b)所示。

图5 澜沧江真核浮游生物群落的空间分布Fig.5 Spatial distribution of eukaryotic plankton community in the Lancang River

隐藻门(Cryptophyta)是澜沧江真核浮游生物中相对丰度最大的一个门，主要分布于澜沧江的下游及中游少数区域，其生态位宽度排在所有类群中的前五。这与之前的研究结果相一致，隐藻能够广泛分布的主要原因在于能够适应各种类型的水体而且不存在季节特异性[23]。

金藻门(Chrysophyta)和硅藻门(Bacillariophyta)主要分布于澜沧江的上游，生态位宽度分别为第七和第五，也属于分布较为广泛的类群。其中金藻门多分布于温度相对较低的水体中[24]，而本次调查中上游的平均水温为3.7 ℃，中下游的平均水温为16.4 ℃，因此水温可能是其分布差异的重要原因之一。硅藻门的分布结果则与之前的研究结果相一致[9]。

纤毛门(Ciliophora)是澜沧江真核浮游生物中生态位最宽的一个类群，该类群广泛分布于澜沧江的上、中、下游。该类群是微食物网的重要组成部分，广泛分布于各类水体中，其分布格局由多种环境因子共同决定[25]。

3.5 澜沧江真核浮游生物群落对环境的响应

使用除趋势对应分析(Detrended Correspondence Analysis，DCA)分析门水平上的浮游生物群落数据，结果排序轴长度<3，因此使用线性模型探究澜沧江真核浮游生物群落对环境的响应。对浮游生物群落数据进行Hellinger转换后进行冗余分析(RDA)。根据方差膨胀系数衡量环境因子中的多重共线性，筛选后使用的环境因子包括：溶解氧(DO)、水温(Temp)、pH、电导率(EC)、碱度(A)、铵盐(NH4-N)、总磷(TP)、正磷酸盐(PO4-P)、总氮(TN)、硝酸盐氮(NO3-N)和二氧化硅(SiO2)，结果如图6所示。

图6 澜沧江真核浮游生物群落对环境的响应Fig.6 Response of eukaryotic plankton community to environmental factors in the Lancang River

RDA所有约束轴的全模型置换检验P值为0.001，说明RDA分析结果可信。分析使用的环境因子中，水温(Temp)和碱度(A)的R2最大(分别为0.64和0.52)，是对澜沧江真核浮游生物群落影响较大的环境因子。水温是被广泛认为能够影响浮游生物分布的重要环境因子；碱度是指水中所含有的能与氢离子相化合的物种含量，包括重碳酸盐碱度、碳酸盐碱度和氢氧化物碱度等，碱度可能会对浮游生物产生毒性[26]，或者影响浮游生物对无机营养物质的同化[27]，从而影响浮游生物的生命活动。

根据Mantel Test对环境因子和不同区域(上、中、下游)种水平上的真核浮游生物群落组成进行相关性检验，不同区域受影响较大的环境因子各有不同，如表1所示。对于上游，铵盐(R2=0.56，P=0.02)和电导率(R2=0.58，P=0.04)相关性显著，根据R2发现电导率是对真核浮游生物群落影响较大的环境因子。对于中游，溶解氧(R2=0.33，P=0.02)、水温(R2=0.34，P=0.02)和碱度(R2=0.26，P=0.05)相关性显著，根据R2发现水温是对真核浮游生物群落影响相对较大的环境因子；对于下游，水温(R2=0.59，P=0.00)、电导率(R2=0.60，P=0.00)、碱度(R2=0.27，P=0.04)、铵盐(R2=0.39，P=0.04)、总磷(R2=0.70，P=0.01)、硝酸盐氮(R2=0.35，P=0.01)和二氧化硅(R2=0.61，P=0.01)相关性显著，根据R2发现总磷对真核浮游生物群落影响相对较大。

表1 基于Mantel Test的真核浮游生物群落组成与环境因子相关性Table 1 Correlation between eukaryotic plankton community composition and environmental factors based on Mantel Test

4 结 论

在澜沧江进行真核浮游生物群落调查，基于18S rRNA宏条形码技术从空间差异、群落组成和环境响应等方面进行了分析，得到以下结论：

(1)澜沧江真核浮游生物群落可以划分为3个分组，包括：上游(自然河道段)、中游(位于水电站乌弄龙和功果桥之间的区域)和下游(功果桥电站及以下区域)，不同类型群落的组间差异要大于组内差异，且差异显著。

(2)上游真核浮游生物群落组成是3个区域中最为均匀的，金藻门和硅藻门是该区域分布较为广泛且相对丰度较高的类群，电导率是对该区域影响较大的环境因子；中游和下游的浮游生物多样性类似，隐藻门是中下游分布较为广泛且相对丰度较高的类群，对中游和下游影响较大的环境因子分别是水温和总磷。

(3)对于整个澜沧江而言，水温和碱度是本次测定的所有环境因子中对真核浮游生物群落有重要影响的因子，纤毛门是分布最为广泛且相对丰度较高的类群。