温洲地区部分奶牛场隐孢子虫种类与分布调查

简永利，涂宜强，王会宝，高永安，王 蒙，于三科，宋军科*

(1.温州科技职业学院 动物科学学院，浙江温州 325006；2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100；3.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种主要寄生于人和多种动物胃肠道和呼吸道上皮细胞内的寄生性原虫，在多数国家和地区广泛分布[1]，引起感染宿主以腹泻为主要临床表现的隐孢子虫病。目前，隐孢子虫已鉴定40多个有效种和70多个基因型[2-3]，主要通过其卵囊污染的水源、食物或接触感染的动物或人等多种途径进行广泛传播[4]。

在家畜中，反刍动物被认为是宿主特异性和人兽共患性隐孢子虫的重要宿主，其排出的大量卵囊可污染周围环境[5]。奶牛可感染的隐孢子虫种类较多，微小隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)和瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)等是奶牛感染的主要常见隐孢子虫虫种，偶尔也有感染猫隐孢子虫(C.felis)、人隐孢子虫(C.hominis)、猪隐孢子虫(C.Suis)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)等其他隐孢子虫种的报道[6-7]。感染后奶牛主要表现腹泻、腹痛、呕吐、体重减轻、产奶量减少等临床症状[8-9]，特别是对小于1月龄的犊牛还可能引起致死性腹泻[10]，这不仅给养牛业造成巨大的经济损失，而且牛感染的C.parvum和C.andersoni等隐孢子虫种类对人类健康有潜在的威胁[1,11]。对我国陕西、河南、黑龙江和宁夏等地区牛隐孢子虫感染情况进行调查结果显示，感染率从4.94%～47.7%不等[1,6-7]，且在不同地区，牛隐孢子虫的种类分布、分子特征等方面存在较大差异。

奶牛产业是我国农业的重要组成部分，我国奶牛养殖量位居世界前列。近年来，浙江温州地区奶牛产业在龙头企业的带动下不断持续向好发展，年存栏量近1万头，但目前尚未有对该地区奶牛隐孢子虫感染情况的报道。本研究通过分子生物学技术对该地区奶牛隐孢子虫感染情况进行调查，分析奶牛隐孢子虫感染情况和种类分布，为奶牛隐孢子虫病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 粪便样品共85份，分别采自位于平阳县、瑞安市、乐清市等浙江省温洲地区的3个奶牛场。其中，3月龄内断奶犊牛样品28份，3月龄～6月龄断奶后犊牛样品14份，6月龄～12月龄育成牛样品26份，1岁以上成年奶牛样品17份(表1)。除1月龄内新生犊牛分开隔离饲养在笼舍内，其他奶牛按照年龄段隔离混合饲养。在奶牛场做好自身生物安全防护措施的前提下，用一次性塑料手套直肠采集粪便，低温运送至温州科技职业学院实验室，每份粪便样品保存于离心管中，并标记动物年龄、采集地点、时间等信息，置于25 g/L重铬酸钾溶液中4℃保存备用。

表1 奶牛粪便样品信息

1.1.2 主要试剂和仪器 25 g/L重铬酸钾溶液，上海试一化学试剂有限公司产品；粪样DNA提取试剂盒，Omega生物科技公司产品；rTaqDNA 聚合酶体系，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；琼脂糖、DNA Marker DL 2 000，宝生生物工程(大连)有限公司产品；PCR仪为eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增 从25 g/L的重铬酸钾溶液中取粪样0.2 g于1.5 mL离心管中，灭菌双蒸水洗涤3次～4次直至上清液清亮，按照DNA试剂盒说明提取粪样DNA，并保存于-20℃备用。引物参照文献[12]，由上海生工生物工程有限公司合成。SSUrRNA基因的PCR反应为套式PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL， MgCl22.0 μL，第1轮(或第2轮)上、下游引物各1.0 μL，rTaq酶0.125 μL，模板DNA 1.0 μL，双蒸水补至25 μL。PCR反应程序参照文献[13]进行。取第2轮PCR产物进行核酸电泳，凝胶成像系统拍摄成像。第2轮阳性PCR产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.2 序列分析 双向测序成功的隐孢子虫基因序列拼接后，用Clustal X1.83软件比对，再对照测序图谱进行校正。校正的序列在GenBank上的Blastn进行同源性比对和分析。用MEGA6.0软件进行种群遗传进化分析，构建Neighbor-Joining进化树。

2 结果

2.1 SSU rRNA基因扩增

用基于SSUrRNA基因的套式PCR对采集的85份粪样DNA进行扩增，在29份粪便样品中成功扩增出约830 bp的目的片段，部分代表性样品的扩增结果见图1。

M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2～7、9.奶牛隐孢子虫阳性粪便样品；8.奶牛隐孢子虫阴性样品；10.阳性对照

2.2 奶牛隐孢子虫感染情况和种类分布

本次调查的3个奶牛场均有隐孢子虫感染，总感染率为34.1%(29/85)。其中瑞安市奶牛场奶牛感染率为12.0%(3/25)，乐清市奶牛场为46.2%(6/13)，平阳县为42.6%(20/47)，乐清、平阳奶牛场隐孢子虫感染率明显高于瑞安奶牛场。不同年龄段的奶牛均有隐孢子虫感染，断奶前犊牛感染率为64.3%(18/28)，其余年龄段感染率由高到低依此为成年奶牛23.5%(4/17)、断奶后犊牛21.4%(3/14)、育成牛15.4%(4/26)(表2)。

表2 温州地区3个奶牛场隐孢子虫感染和虫种分布情况

基于SSUrRNA基因的序列比对分析，结果显示，温州地区奶牛场共检出4种隐孢子虫种，即牛隐孢子虫(C.bovis)、瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)和奇异隐孢子虫(C.occultus)。在29份阳性样品中，C.bovis的感染数最多，占比最高，且分布范围广，是温州地区奶牛场感染的优势虫种。结果表明，奶牛场普遍感染2种～3种隐孢子虫，其中瑞安牧场奶牛感染的有C.bovis和C.ryanae，乐清奶牛主要感染的有C.andersoni和C.occultus，而平阳奶牛感染有3种隐孢子虫种，分别为C.bovis、C.ryanae和C.andersoni。另外，C.bovis、C.ryanae和C.andersoni等3个种类在断奶前犊牛、断奶后犊牛和育成牛都有分布，但C.bovis和C.ryanae主要集中分布于断奶前犊牛，是断奶前犊牛感染的优势虫种。C.andersoni分布于各年龄段，但主要集中分布于断奶前犊牛和成年奶牛。此外，在乐清牧场1个断奶后犊牛的样品中检出了C.occultus。

2.3 序列分析

将29份粪便阳性样品送上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序，除3个样品测序不成功以外，其他序列拼接后再用Clustal X1.83软件比对校正，总共得到26条序列。序列比对结果显示，9份为牛隐孢子虫、7份为瑞氏隐孢子虫、9份为安氏隐孢子虫、1份为奇异隐孢子虫。

基于SSUrRNA基因位点对本研究中的隐孢子虫进行分类鉴定，以卵形疟原虫(Plasmodiumovale，GenBank登录号： KP050371)作为外群，利用MEGA6.0软件对获得的序列进行种群遗传进化树分析(图2)。结果表明，分别有9个序列与C.bovis、7个序列与C.ryanae、9个序列与C.andersoni、1个序列与C.occultus分别聚在同一分支上，亲缘关系较近。

图2 牛隐孢子虫SSU rRNA基因序列系统进化树

3 讨论

隐孢子虫隶属于顶复门重要原虫，主要寄生在人和动物的胃肠道，导致宿主出现轻度、中度甚至重度腹泻。研究表明，奶牛普遍感染隐孢子虫，但不同国家或地区感染率不同。马来西亚牛隐孢子虫的总感染率为12.5%[14]，埃及奶牛的感染率为9.7%[15]，日本断奶前犊牛感染率为83.8%[16]。本次调查中，85份奶牛样品中，有29份样品检出隐孢子虫阳性，3个奶牛场隐孢子虫的总感染率达34.1%，其中乐清市和平阳县奶牛场奶牛隐孢子虫的感染率达40%以上。与国内奶牛隐孢子虫感染情况相比，其感染率高于曾经在宁夏(1.61%，23/1366)、四川省(14.4%，40/278)、广东省(24.0%，93/388)的调查结果[17-19]，也高于在牦牛(20.92%)、肉牛(10.47%)、水牛(15.50%)的调查结果[7]。本研究中，奶牛隐孢子虫感染率明显高于其他地区，这可能与该地区湿热的气候、地理环境、饲养方式、动物品种与年龄、检测方法等因素有关。

研究表明，隐孢子虫的感染与日龄相关，随着奶牛日龄增加，隐孢子虫感染率呈明显下降趋势[4,15]。本次调查中，各年龄段的奶牛均存在隐孢子虫感染，断奶前犊牛感染率最高(64.3%)，而断奶后犊牛(21.4%)和育成牛(15.4%)的感染率稍低，这也与此前的研究报道结果相一致[19-20]，但成年奶牛的感染率(23.5%)略高于断奶后犊牛和育成牛。此外，有调查结果显示，牛隐孢子虫种类分布也具有一定的年龄相关性，断奶前犊牛主要感染C.parvum，而断奶后犊牛感染有C.bovis和C.ryanae，而C.andersoni则主要感染育成牛和成年牛[4,6,19-20]。本研究表明，温州地区3个奶牛场的奶牛感染的隐孢子虫种类有4种，分别为C.bovis、C.andersoni、C.ryanae和C.occultus，其中断奶前犊牛感染3种隐孢子虫，即C.bovis、C.ryanae和C.andersoni，C.bovis和C.ryanae是断奶前犊牛感染的优势虫种，这与我国陕西、四川等地区调查的结果基本一致[21-22]，而与河南、新疆等地报道不同，断奶前犊牛主要感染的是C.parvum[3,23]。C.andersoni在各年龄段奶牛均有分布，但主要集中分布于断奶前犊牛和成年奶牛。

因C.occultus与C.suis遗传进化关系较近，此前曾被命名为C.suis-like，后来发现其卵囊比C.suis小，具有明显形态学差异，因此， Kvác M在2018年将其命名为一个新的有效种[24]。C.occultus可感染牛、牦牛、水牛、老鼠等广泛的宿主，但主要感染的宿主为老鼠。我国也有牛、牦牛、野鼠感染的情况[25-26]，广西也有儿童感染C.occultus的首例报道[27]。本次调查中，乐清牧场的1个断奶后犊牛样品中检出了C.occultus，提示存在人兽共感染的风险，建议该牧场需加强奶牛粪便管理工作，避免造成食物、水源的污染。

C.parvum是一种重要的人兽共患原虫[27]，主要感染断奶前犊牛，近年来新疆、江苏、河北等多地报道了新生犊牛因感染C.parvum而暴发隐孢子虫病的案例[3,9,28]。而本次调查中，并未检测到奶牛感染C.parvum，一方面可能是由于断奶前犊牛排出的C.bovis和C.ryanae卵囊量较多，而用于多种隐孢子虫鉴定的分子生物学技术优先扩增DNA含量较高的样本，另一方面也提示该地区奶牛传播微小隐孢子虫对人的风险较低。