蒙药那仁满都拉调控Wnt/β-catenin信号通路抗骨质疏松的作用及机制

余自层 郭杨 马勇, 潘娅岚 韩秋革 肖吉日木图 刘孟敏

1.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023

2.南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室，江苏 南京 210023

3.南京中医药大学中西医结合护理研究所，江苏 南京 210023

4.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110

蒙医药作为祖国医药的一部分，在防治骨质疏松方面有其特有的经验及疗效。蒙医学认为，骨质疏松症归属“骨赫依病、骨枯症”范畴。原因在于三根“赫依、希拉、巴达干”失衡，七素“食物精华、血、肌肉、脂肪、骨骼、骨髓、精”清浊代谢紊乱，从而导致骨强度下降，形成骨枯症[1]。蒙药那仁满都拉又名升阳十一味丸，出自《至高要方》，是内蒙地区常用复方之一，由石榴、肉桂、益智仁、荜茇、红花、小蜀季、玉竹、黄精、天门冬、蒺藜、天花粉组成，现已收载于《中华人民共和国卫生部药品标准-蒙药分册》。其具有增强胃火、促消化、补肾壮阳、促进清浊代谢、抑制骨枯、赫依病等功效[2]，常用于痞病、水肿、遗精、腰痛、寒泻、骨痛等寒性病症。长期临床应用中发现那仁满都拉可缓解骨质疏松引起的疼痛，增加骨量，但其作用机制尚不完全清楚[3]。

既往研究发现，骨质疏松的发生发展受多种通路影响，其中Wnt/β-catenin信号通路是骨生长、发育中的经典通路[4]；Wnt通路可促进成骨细胞的生成，抑制破骨细胞的分化，在平衡骨生成与骨代谢中至关重要[5]。Wnt蛋白与其受体结合通过增加β-catenin蛋白的表达，减缓成熟成骨细胞的凋亡，进而缓解骨质疏松症的发生发展[6]。基于此，本研究构建去卵巢大鼠和成骨细胞作为研究对象，通过体内实验观察蒙药那仁满都拉对大鼠骨密度，骨病理切片、骨骼力学及Wnt/β-catenin蛋白表达水平的影响；通过体外实验观察蒙药那仁满都拉含药血清对成骨细胞ALP分泌、矿化及Wnt/β-catenin蛋白表达水平的影响。探索那仁满都拉防治骨质疏松症的作用及机制，为后续蒙医药防治骨质疏松症提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物：2月龄SPF级SD雌鼠共30只，体重为(250±15)g，动物合格证书：SCXK(浙) 1019-0002(南京中医药大学动物伦理委员会的批准：A200904)；1日龄SPF级SD雌鼠共5只，体重为(10±5)g，动物合格证书：SCXK(沪)2018-0004，由南京江宁区青龙山动物实验中心提供。

1.1.2试剂：蒙药那仁满都拉丸(内蒙古蒙药股份有限公司，国药准字：Z15020446)；碱性磷酸酶显色试剂盒、矿化染色试剂盒(中国碧云天生物技术公司)；兔抗大鼠Wnt单克隆抗体(货号：AF5315)购于美国Affinity公司、兔抗大鼠β-catenin单克隆抗体(货号：51067-2-AP)购于中国Proteintech公司、山羊抗兔IgG(货号：GB23303)购于中国赛维尔生物科技有限公司；切片石蜡、HE染液、脱钙液、二甲苯、多聚甲醛购于中源叶生物有限公司。

1.1.3仪器：倒置荧光显微镜DMI3000B型(德国Leica)；生物力学测试系统Acumen3型(美国 MTS)；小动物Micro-CT成像系统Quantum GX型(美国PerkinElmer)；全自动硬组织切片机RM2265型(德国 Leica)；全自动组织染色机YD-700型(金华益迪)；全能型蛋白转印系统Trans-Blot Turbo(美国 Bio-Rad)。

1.2 动物模型制备及取材

所有大鼠随机分为5组(假手术组、模型组、蒙药低剂量组、蒙药中剂量组、蒙药高剂量组)，选用异氟烷吸入式麻醉后，模型组与用药组于脊柱两侧旁开约1 cm处行2 cm左右的切口，逐层剪开后找出卵巢，行卵巢切除手术，逐层缝合。假手术组行切开皮肤缝合手术。术后3 d伤口涂抹青霉素软膏预防伤口感染。8周后检测骨密度相关指标验证造模成功与否。

分组及取材：假手术组与模型组用生理盐水灌胃，每天2 mL；蒙药低剂量组按照0.2 g/(kg·d)，每天2 mL；蒙药中剂量组按照0.4 g/(kg·d)，每天2 mL；蒙药高剂量组按照0.8 g/(kg·d)，每天2 mL。连续12周后，麻醉后取双侧股骨液氮中保存。

1.3 Micro-CT、骨骼力学检测

采用Micro-CT技术观察大鼠骨结构和矿物质变化。应用微CT成像系统(Analyze12)进行CT扫描和小梁形态分析。空间分辨率为9 μm (X射线源80 kv，384 μA；用1 mm滤镜)扫描右侧股骨标本。然后分别用内置软件CT-vox和CTAn重建CT图像。将左侧股骨标本提前从生理盐水取出，使用镊子将标本放置在生物力学测试仪上，调整跨距与加载速度分别为1.5 cm、0.01 mm/s，直至股骨最终断裂为实验终点。仪器所记载的载荷-位移曲线，计算出最大负荷、最大挠度和刚度[7]。

1.4 HE染色

右侧股骨4%多聚甲醛固定48 h后，生理盐水冲洗4次，每次15 min，放入EDTA脱钙液中，置于室温中脱钙6周，直至1 mL注射针头能刺穿股骨后停止脱钙。随后进行脱水、石蜡包埋、仪器切片等步骤，按HE染色步骤染色后，显微镜下观察骨形态变化[8-9]。

1.5 蛋白质印迹法检测

各组细胞及组织Wnt、β-catenin蛋白表达差异，第3代细胞以2×106/mL接种于6孔板，含药血清干预培养2 d，提取细胞总蛋白，以BCA蛋白测定试剂盒测定样本蛋白浓度，加入上样缓冲液定量分装，95 ℃煮沸10 min使蛋白变性，预制胶电泳后PVDF转膜，快速封闭液封闭15 min，TBST清洗3次，每次5 min，加入相应的一抗(Wnt、β-catenin)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次。加入兔抗大鼠二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，化学发光法检测不同样品相应蛋白表达情况。

1.6 成骨细胞的提取与培养

将乳鼠浸泡于75%乙醇5 min，无菌条件下取出颅骨，置于3%双抗的PBS溶液中剔除筋膜组织，剪碎骨片，0.25%的胰酶培养箱中消化30 min，全陪终止消化，离心(1 000 r/5 min)后去上清加入0.1%一型胶原酶，恒温震荡箱(37 ℃，80 r/h)4 h，70 μm滤网去除骨碎片后离心(1 000 r/5 min)去上清，PBS冲洗一遍，全培接种于T25培养瓶中，当细胞汇合度到90%左右时，0.25%胰酶消化1.5 min后全陪终止消化，离心(1 000 r/5 min)，去上清加入全陪传代，取第3代细胞进行后续实验。

1.7 含药血清的制备

蒙药那仁满都拉丸(内蒙古蒙药股份有限公司，国药准字：Z15020446)蒙药低剂量组按照0.2 mg/(kg·d)，每天2 mL。蒙药中剂量组按照0.4 mg/(kg·d)，每天2 mL；蒙药高剂量组按照0.8 mg/(kg·d)，每天2 mL。空白组灌胃生理盐水2 mL。共4组每组3只，连续给药3 d，末次灌胃2 h后用2.5%的戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，4度静置2 h后离心(3 500 r/min，10 min)，取上层血清，0.22 μm滤膜除菌，放-80 ℃保存。

1.8 碱性磷酸酶染色、茜素红染色

第3代细胞以适当密度接种于两块6孔板中贴壁后分别将10%的含药血清加入成骨诱导培养基(50 μg/mL维生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松，配制诱导液进行诱导)，干预诱导细胞14 d，弃掉细胞培养液，PBS清洗1 次，4%中性多聚甲醛固定15 min，其中一块加入碱性磷酸酶染色液于室温下避光孵育30 min，生理盐水清洗3遍，烘箱60 ℃烘干，另一块加入茜素红染色液均匀覆盖细胞，室温染色30 min后蒸馏水充分洗涤。倒置显微镜下观察并拍照。观察各组细胞碱性磷酸酶表达差异与矿化结节差异。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 那仁满都拉对骨小梁及骨骼力学性能的影响

用Micro-CT结果显示那仁满都拉可明显提高大鼠骨小梁密度，同时改善骨微结构参数，其中中、高剂量组效果优于低剂量组(见图1)；那仁满都拉可提高骨骼力学的载荷与刚度(P<0.01，P<0.05)，但其最大位移差异无统计学意义(见表1)。

图1 各组Micro-CT矢状面与冠状面二维扫描图Fig.1 Micro-CT sagittal and coronal two-dimensional scans

表1 蒙药那仁满都拉对各组大鼠骨骼力学的影响Table 1 Effects of Mongolian medicine Narenmandura on the skeletal mechanics of rat groups

2.2 那仁满都拉对骨组织病理学形态的影响

骨组织病理染色结果显示假手术组大鼠骨小梁排列紧密，结构清晰，空腔较小；模型组骨小梁断裂明显，结构错乱，空腔密集；那仁满都拉用药组中、高剂量组可明显改善骨小梁病理变化，与模型组相比骨小梁断裂较少，排列较为紧密，空腔减少(见图2)。

图2 各组大鼠股骨组织病理染色结果(100×)Fig.2 Results of pathological staining of femoral tissues in each group (100×)

2.3 那仁满都拉对骨组织Wnt、β-catenin蛋白表达水平的影响

Western blot法检测各组股骨组织中Wnt、β-catenin蛋白表达水平结果显示，模型组中Wnt、β-catenin蛋白水平较假手术组显著减低(P<0.000 1)，而那仁满都拉用药组可改善这一状况，差异具有统计学意义(P<0.000 1)(见表2、图3)。

表2 各组大鼠Wnt及β-catenin蛋白水平检测结果Table 2 Test results of Wnt and β-catenin protein levels in each group

图3 各组大鼠Wnt及β-catenin蛋白水平检测结果Fig.3 Wnt and β-catenin protein levels results in the rats

2.4 那仁满都拉含药血清对成骨细胞碱性磷酸酶及矿化的影响

各组细胞ALP染色结果显示，正常组与含药血清组细胞均呈紫色深染；其中高剂量含药血清组细胞深染面积最大，阳性率明显高于空白血清组；低、中剂量含药血清组深染面积较空白组略有提高。说明含药血清组均可促进成骨细胞ALP的分泌，高剂量组更明显(见图4A)。各组细胞在连续干预14 d后进行矿化染色发现，4组细胞均有被染为橘红色的矿化结节形成，其中那仁满都拉含药血清高剂量组细胞矿化结节数量较多，体积增大，提示那仁满都拉含药血清可以促进成骨细胞矿化(见图4B)。

图4 那仁满都拉含药血清对成骨细胞碱性磷酸酶分泌及矿化的影响A：碱性磷酸酶染色；B：矿化结节染色Fig.4 Effect of Narenmandula-containing serum on alkaline phosphatase secretion and mineralization of osteoblastsA： Alkaline phosphatase staining; B： Staining of mineralized nodules

2.5 那仁满都拉含药血清对成骨细胞Wnt、β-catenin蛋白表达水平的影响

比较各组含药血清对成骨细胞Wnt、β-catenin蛋白表达水平的影响，因此采用Western blot法对各组进行检测，4组成骨细胞的Wnt、β-catenin的水平差异都具有统计学意义，其中含药血清中、高剂量组Wnt、β-catenin蛋白表达明显高于空白组(P<0.000 1)(见表3、图5)。

表3 各组成骨细胞Wnt及β-catenin蛋白水平检测结果Table 3 The results of Wnt and β-catenin protein levels

图5 各组成骨细胞Wnt及β-catenin蛋白水平检测结果Fig.5 Wnt and β-catenin protein levels osteoblasts

3 讨论

蒙药那仁满都拉共有11味草药，以石榴为君药，肉桂、玉竹共为臣药，三药配伍，具有增强胃火，分解精微和糟粕，补肾健脾。佐以荜茇、红花、益智仁、蒺藜、黄精、天门冬、小蜀季、天花粉，以治其标。现代药理学实验发现，蒙药那仁满都拉对小鼠血清中的氧自由基及脂质过氧化物均有较强的清除作用，并能调节内分泌系统和机体能量代谢发挥抗疲劳作用[10]。田宏等[11]发现蒙药那仁满都拉可发挥免疫调节作用治疗寒盛型肾小球肾炎。复方中包含糅质、生物碱、挥发油、多糖、黄酮类、甾类成分，均具有临床效应。石榴籽油及其活性化合物通过抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞生成，在骨质疏松症中发挥骨保护作用[12-13]。从天门冬中分离出来的麦冬素，通过减少体内的活性氧发挥抗骨质疏松的作用[14]。同时，黄精、玉竹通过调节ERK/GSK-3β/β-Catenin等信号通路，促进骨髓间充质干细胞向成骨分化[15]。综上，此复方中的各种草药中都含有抗骨质疏松症的活性成分，然而复方草药配伍比单一用药更有效地治疗骨质疏松症。

在本研究中，Micro-CT检测骨小梁的结果并进行矢状面与冠状面二维结构展示，模型组的骨小梁密度远低于假手术组，表明大鼠去卵巢手术可导致大鼠骨小梁减少、骨质流失，而蒙药组均改善这一现象。HE染色与骨骼力学检测也进一步验证了以上实验结果，提示蒙药那仁满都拉可以显著改善去卵巢大鼠的骨微结构，增加骨小梁丰度，提高骨骼力学性能。在体外实验中发现，蒙药含药血清可以促进成骨细胞增殖、增加ALP分泌和诱导钙化结节的形成，这提示那仁满都拉抗骨质疏松效应可能与提高成骨细胞成熟、分化能力有关。

Wnt/β-catenin信号通路调节生物体的许多发育过程，维持组织中内环境的平衡。有研究者发现，Wnt的缺失会导致骨质疏松症假胶质瘤，这是一种以骨量低、骨形成率低为特征的疾病，这表明Wnt蛋白在骨形成中也起着关键作用[16-17]。β-catenin是Wnt信号通路的关键调节因子[18]。当Wnt信号通路被激活时，β-catenin与核转录因子TCF/LEF结合，激活下游靶基因，从而促进成骨细胞的分化和增殖[19]。Jin等[20]在敲除β-catenin基因的动物实验中发现，骨组织中I型胶原、骨钙素的表达显著降低，Mirco-CT显示骨小梁减少、骨质流失，并导致骨质疏松症。ALP是成骨细胞分化的特异性标志物，可以促进骨形成和骨矿化[21-22]。ALP通过促进成骨细胞合成新的胶原基质，并释放膜结合的基质小泡来调节基质的矿化，成骨细胞被基质包围后成为骨细胞[23]。实验研究观察到，该方能改善骨质疏松模型大鼠骨小梁形态，提高骨生物力学及骨密度，改善骨微环境，促进Wnt、β-catenin蛋白的表达，具有防治骨质疏松的作用。此外，还可促进成骨细胞活性，增加ALP表达，促进其矿化，提高成骨细胞Wnt、β-catenin蛋白的表达水平。因此，本研究认为蒙药那仁满都拉可能通过Wnt/β-catenin信号通路发挥其抗骨质疏松作用。

综上所述，蒙药那仁满都拉在体内体外实验中均具有良好的药效，也进一步揭示了那仁满都拉作为一种安全有效的抗骨质疏松药物的潜能；同时验证了蒙医“三根七素”理论指导下形成的那仁满都拉，其显著的抗骨质疏松效应与促进骨形成、骨再生有关，但其具体作用机制有待进一步研究。随着国家对民族医药事业支持力度的不断提高，以及对骨质疏松症的逐步重视，蒙药的运用与开发愈发被重视，为蒙药那仁满都拉的发展提供了良好的机遇。在蒙医药理论指导下，针对蒙药特性开展药效物质基础研究。通过结合中医药现代化的模式，探索蒙医药现代化的共性技术，开展蛋白质组学筛选靶点及作用通路，为蒙药那仁满都拉防治骨质疏松提供新依据。