干湿交替循环频率对生物膜特征及其微生物群落的影响

李春艳,谢珊珊,王文文,朱时俊,闻 晨,李妮鸿,骆 霞*

干湿交替循环频率对生物膜特征及其微生物群落的影响

李春艳1,2,谢珊珊1,2,王文文1,2,朱时俊1,2,闻 晨1,2,李妮鸿1,2,骆 霞1,2*

(1.云南大学,国际河流与生态安全研究院,云南 昆明 650500；2.云南省国际河流与跨境生态安全重点实验室,云南 昆明 650500)

为研究干湿交替循环下生物膜的抗性机制,以天然水体生物膜为研究对象,基于室内控制实验,通过16S rRNA高通量测序和激光共聚焦显微成像等技术,探究干湿交替循环对生物膜形态结构及其微生物种群结构、多样性和功能的影响.结果表明,随着干湿交替循环频率从一轮(C1)增加到五轮(C5),生物膜厚度从9.10减小到6.46µm,胞外聚合物含量从2.64μm3/μm3(对照)减少到1.90μm3/μm3(C1),再增加到4.41μm3/μm3(C3),随后减少到1.54μm3/μm3(C5,=0.004),活/死菌比例则从2.52(C1)增加到3.60(C3)再显著减少到0.72(C5,=0.009),而比表面积和粗糙度系数无显著变化.与对照相比,干湿交替循环下生物膜内微生物群落丰富度和多样性下降,指示物种发生改变.当干湿交替循环的频率超过生物膜耐受程度(C5)时,生物膜内优势菌由变形菌转变为与蓝藻相关的菌群,且生物膜功能由化能异养转变为光合自养.可见,不同干湿交替循环频率下生物膜形态结构和微生物种群结构不同,且在干湿交替循环频率较低时生物膜内微生物群落的生存策略表现为抵抗力,频率较高时表现为恢复力.

干湿交替循环；生物膜；微生物群落；抵抗力；恢复力

随着全球气候变化加剧以及人口激增导致的用水量增加,间歇性河流中常见的干湿交替循环频繁发生[1-3],直接或间接影响河流微生物的种群结构、分布和多样性[4-6].因此,研究和预测微生物种群对干湿交替循环在结构和功能等方面的响应机制逐渐成为微生物生态学家关注的热点[7].生物膜是由细菌、藻类和真菌等微生物组成,并包裹在由它们自己分泌的胞外聚合物中的复杂有机体中[8].它是自然界中微生物种群存在的主要形式[8],可通过影响水体净化、有机物和矿物质的生物地球化学循环以及河流生态系统的初级生产等过程[7,9],进一步影响生态系统的功能.

当微生物种群受到干湿交替等环境胁迫时,其结构和功能可能维持原状(表现为抵抗力)[10],也可能先发生改变再恢复到原状或达到新的稳定状态(表现为恢复力)[7,11].现有的一系列室内和室外模拟实验结果表明干湿交替循环对微生物群落产生影响,如干旱会使得藻类多样性[12]和生物量减少[13]、细菌群落组成丰富度和多样性降低[14-15].干旱脱水的速度和强度决定了生物膜的结构响应[16],在此阶段,生物膜的活性叶绿素减少,光合能力降低[17].湿润恢复后,生物膜的自养成分会表现出更高的恢复力[18],且Luo等[19]观察到再润湿生物膜样品中细菌群落的丰富度、多样性和均匀性普遍呈下降趋势.此外,干湿交替还会改变可降解性有机碳的可利用度从而诱发微生物种群演替[20],会促进丝状藻类的增殖[7,19,21],还会促进新生物膜的形成,最终改变了微生物群落组成[19].然而,有关生物膜内微生物种群对干湿交替循环的抵抗力和恢复力机制还鲜有报道.

本课题组前期通过室内模拟实验研究发现,生物膜内微生物种群经过5d干旱后种群结构和多样性发生显著改变,且经5d湿润处理后,种群结构和功能仍然无法恢复到初始状态[19].基于此,本研究运用16S rRNA高通量测序和激光共聚焦显微镜成像等技术,探究干湿交替循环对生物膜形态结构、微生物种群结构、多样性和功能的影响,揭示生物膜对干湿交替循环频率的抗性机制,以期进一步认识间歇性河流中微生物群落对环境变化的适应和演变机制,并为维持水生生态系统功能的稳定提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存

采集的水样和生物膜来自于沘江源头(26°32'59.99"N, 99°26'7.47"E),采样时间为2021年4月.采集的水样放入无菌塑料桶(4×25L),经0.22µm水系滤膜过滤后冷藏于4℃的冰箱,用于后续生物膜的培养.生物膜使用海绵刷刮取,挤压进灭菌后的1L聚丙烯瓶(12×1L)中,采集到的生物膜分别经过0.85mm筛网过滤掉大颗粒杂质,250μm滤纸和100μm滤纸(高分子纤维素)过滤掉小型底栖动物[22].过滤后的生物膜样本进行冷冻离心,离心条件为10000,20min.根据Luo 等[23]的方法,使用最终浓度为10μg/mL的吖啶橙(Acridine Orange, AO)染液,在避光条件下对2mL离心后的生物膜样品染色20min后,过滤到孔径为0.2µm、直径为25mm的黑色聚碳酸酯滤膜上,最后用磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH=7.4)溶液冲洗,将样品置于荧光显微镜(DM3000,徕卡,德国)测定混匀后的生物膜样本中的细菌数量.将生物膜样本加入30%的甘油,混匀、分装至每份样本含108个细菌细胞,保存至-80℃超低温冰箱备用.

1.2 实验设置

生物膜用4个尺寸完全相同的旋转环形生物膜反应器(内含12片聚碳酸酯挂片,11.4×1.2cm2,厚1mm)以连续流的形式进行培养,该反应器被广泛用于生物膜在室内的培养,这是由于其可以模拟室外生物膜的生长条件[24-25]生物膜在挂片上生长6周后,对照组(Control)不作处理,实验组以1d干旱和1d湿润为一个循环周期,分别进行1(C1)、3(C3)、5(C5)轮干湿交替处理.干旱期间,停止蠕动泵并排空反应器,使反应器暴露在平均光照为(15300±9646)lx下运行24h,光/暗周期为16h/8h;湿润期间,向反应器注入500mL经0.22µm滤膜过滤的原水后,以连续流在上述光照条件下继续运行24h.处理完毕后,停止蠕动泵及反应器旋转马达,排空反应器内液体.分别从4个反应器中取出挂片:1片用于测定胞外聚合物(EPS)及生物膜表征参数,1片用于测定生物膜表面形态.剩余10片用0.9% NaCl溶液轻轻冲洗3次,以便去除表层未固定的生物量.利用细胞刮刷(康宁, cat# 3010,美国)将生物膜从挂片表面刮落至含有矿物水的已灭菌塑料瓶中[26],定容到100mL,用于测定生物膜微生物种群结构、活死菌比例.整个实验重复一次,每轮实验设置两个平行样.

1.3 样品分析

1.3.1 生物膜生长情况监测 根据Luo等[27]的方法,每周从4个反应器中各取出两片挂片,通过光学显微镜(DP72Olympus,日本)测定生物膜厚度.将40倍物镜降至生物膜表面顶部处于焦点位置处,记录刻度.继续降低物镜至挂片表面焦点处,再次记录刻度.生物膜厚度为两次读数之差,每片挂片读数50次,取平均值.

1.3.2 生物膜干重测定 将0.22µm的玻璃纤维滤膜称重.取一定体积的生物膜悬浮液于0.22µm的玻璃纤维滤膜中进行过滤,将滤膜放入烘箱中在105℃下干燥至恒重[28].待滤膜冷却至室温时再次称量滤膜重量.生物膜悬浮液的干物质重量等于烘干后质量减去烘干前质量,生物膜干重以每升悬浮液的干物质重量表示.

1.3.3 活死菌比例 使用1:1混合的绿色荧光染色剂NO1(激发波长:488nm;发射波长:525nm)和红色荧光染色剂碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)(激发波长:540nm;发射波长:620nm)(活细菌/死细菌双染试剂盒,KTA1001,Abbkine,美国)按照厂家说明书对1mL生物膜悬浮液样本避光染色15min.染色后的样品过滤到孔径为0.2µm、直径为25mm的黑色聚碳酸酯滤膜,用0.85%氯化钠溶液冲洗样品去除多余染剂,置于激光共聚焦显微镜(DM3000, Leica, German)下拍摄.

1.3.4 EPS含量和藻类测定 将挂片切割成8个1cm×1cm的小片,4片用于测定生物膜内EPS含量及藻类,剩余4片用于测定生物膜的表征参数(厚度、表面粗糙度和比表面积).EPS含量:使用罗丹明-麦芽凝集素(WGA)(激发波长:568nm;发射波长: 680nm)(iFluorTM 555-Wheat germ agglutinin, AAT Bioquest,美国)按照厂家说明书对生物膜内EPS避光染色20min,用PBS缓冲液(pH=7.4)冲洗样品去除多余染剂.自发荧光用于测定生物膜内的藻类:蓝藻(激发波长:567nm;发射波长:630±30nm)、藻类(蓝藻+绿藻)(激发波长:647nm,发射波长:665nm)[29].染色后的样品置于激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)(TCS SP8STED, Leica, German)下进行连续“光学切片”断层扫描,设置通道1(EPS)、通道2(蓝藻)、通道3(蓝藻+绿藻).生物膜表征:使用核酸染剂MycoLight Green JJ98(激发波长:488nm;发射波长:530nm)(AAT Bioquest, 美国)按照厂家说明书对生物膜细胞避光染色20min,用0.85%氯化钠溶液冲洗样品去除多余染剂,置于CLSM下进行连续“光学切片”断层扫描.获得的光学切片图像经COMSTAT(V 2.1)软件处理分析后可确定生物膜内EPS含量、厚度、表面粗糙度和比表面积[30].

1.3.5 生物膜表面SEM分析 将挂片切割成1cm×1cm的小片,并用双面胶固定在直径35mm的小培养皿中.样品经过2.5%戊二醛在4℃下固定24h,固定完成后分别用20%、40%、60%、80%、90%无水乙醇脱水一次,100%无水乙醇脱水两次[31].将样品喷金后在扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)(FEIQuanta-200,FEI,美国)下观察其表面形态结构.SEM拍摄倍数分别为放大1000倍和放大5000倍,每个倍数下拍摄3张图片.

1.3.6 DNA提取和高通量测序 取3mL生物膜悬浮液混合均匀,分别取1mL混合悬浮液于0.22µm滤膜过滤,将滤膜剪成碎片并放入10mL冻存管中.根据制造商的方法,使用HiPure Soil DNA试剂盒(D3141,广州美基生物科技,中国)提取生物膜DNA.使用引物341F和806R对进行聚合酶链式反应(PCR)以扩增16S rRNA基因的V3-V4区域[32].PCR扩增在含有10μL反应缓冲液,10μL GC增强剂(High GC Enhancer),1.5μL 2.5mmol/L dNTPs,1.5μL上下游引物(10μmol/L),0.2μL High-Fidelity DNA聚合酶和50ng模板 DNA的50μL混合物中进行.PCR扩增条件如下:95℃下5min, 95℃下1min,60℃下1min,72℃下1min进行30个循环,最后 72℃下7min.从2%琼脂糖凝胶中搜集扩增子,使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences,美国)纯化扩增子,并使用ABI StepOnePlus实时PCR系统(Life Technologies,美国)进行定量.纯化后的扩增子根据标准操作在Illumina平台上进行测序.原始序列由QIME(V 1.9.1)过滤[33].使用UPARSE(V 9.2.64)[32](Edgar, 2013)按照³97%的相似度将细菌序列聚类到操作分类单元(Operational taxonomic units,OTUs)中,使用SILVA(V 132)数据库进行物种分类注释[34].

1.4 数据处理与分析

使用SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)检验干湿交替循环后生物膜结构、组成的差异.物种丰度堆叠图使用R语言ggplot2包(V 2.2.1)[35]展示.使用R语言Vegan包(V3.4.2)[36]计算非度量多维尺度(NMDS)分析和相似性分析(ANOSIM),测定NMDS结果和β多样性的显著性,以说明干湿交替循环引起的生物膜群落组成的变化.利用R语言labdsv包(V 2.0-1)[37]中的函数IndVal,进行指示物种分析,以探究干湿交替后指示物种的差异.在QIIME(V 1.9.1)[33]中计算α多样性指数.利用FAPROTAX数据库和相关软件(V 1.0)[38]生成生物膜的生态功能图谱.

2 结果与讨论

2.1 干湿交替循环频率对于生物膜形态结构的影响

图2 生物膜的CLSM拍摄图;从左往右依次为通道1(EPS)、通道2(蓝藻)、通道3(蓝藻+绿藻)和上述三种合并通道(Combined);合并通道中红色为EPS,粉色为蓝藻,蓝色为绿藻;刻度尺=10μm

使用COMSTAT软件对CLSM下拍摄的图片进行处理,得到生物膜的EPS含量、粗糙度系数、平均厚度、比表面积和活/死菌比(图1).生物膜内EPS含量随干湿交替循环频率的增加呈现先减少后显著增加(= 0.008)再显著减少的趋势(=0.004)(图1a),EPS具有帮助生物膜内微生物有效应对外界压力的作用[34].当干旱频率较低时(C1),EPS通过被生物膜内微生物所消耗的方式来维持新陈代谢[40],从而导致EPS含量减少(2.64～1.90µm3/µm3),经一天湿润后EPS含量仍无法恢复到初始水平.随着干湿交替循环频率的增加,C3生物膜内EPS含量从1.90增加到4.41μm3/μm3(= 0.008)来保护细菌免受脱水的伤害[39],而当干湿交替循环频率超过生物膜耐受程度(C5)时,大量微生物死亡,生物膜内活/死菌比显著下降(=0.009)(图1e),进而导致其分泌的EPS含量剧烈减少(=0.004).此外,经干湿交替循环后生物膜粗糙度(图1b)和厚度(图1c)降低,其中干湿交替循环对生物膜厚度的影响尤为显著(对照vs C3:=0.012,对照vs C5:=0.005).生物膜厚度的减少可归因于干旱胁迫导致部分微生物死亡,并在复水时引发脱落[41-42].

使用CLSM分别对EPS(通道1)、蓝藻(通道2)、藻类(通道3)和上述三种合并通道进行拍摄(图2).从通道1可以明显观察到C3生物膜EPS含量最高,而C5生物膜的EPS含量最低,这一结果与COMSTAT软件计算得到的含量相一致(图1a),此外,在C5中观察到了大量藻类.使用SEM分别在放大1000和5000倍下观察到生物膜的形态结构(图3),与CLSM结果相一致,在放大1000倍下观察到C3生物膜中明显的团聚现象可归因于EPS的增加,在放大5000倍下观察到C5生物膜中观察到了大量丝状藻类的出现.

图3 生物膜的扫描电镜(SEM)图

2.2 不同干湿交替循环频率对于生物膜内微生物群落结构和功能的影响

2.2.1 不同干湿交替循环频率下微生物群落物种分析和生物膜功能分析 微生物群落门水平分析结果显示(图4a),对照、C1和C3处理下生物膜样本中优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria),平均占比为(51.48±8.43)%.这与Luo等[19]观察到的结果一致,而在C5样本中的优势菌门是蓝藻门(Cyanobacteria),平均占比为46.17%.该结果表明,在干湿交替循环下变形菌门的相对丰度较高,与对照处理相比,干湿交替循环频率的增加有助于变形菌门相对丰度的增加,但当干湿交替循环频率超过生物膜的耐受程度(C5)时,变形菌门相对丰度显著减少(<0.001).有研究表明,从潮湿到干燥的环境,地中海临时河流沉积物中变形菌门相对丰度增加可归因为该菌群具有一定的抗干燥能力[43],由于EPS中的有机物容易被微生物当作营养物而分解[44],因此,当增加干湿交替循环频率(C5)时,EPS的减少会抑制微生物活性和微生物群落的生长,从而导致许多微生物群落的相对丰度显著降低,包括变形菌门(<0.001)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(=0.001)和疣微菌门(Verrucomicrobia) (<0.001).然而,与蓝藻相关的菌群,相对丰度随干湿交替循环频率的增加而显著增加(对照vs C3,=0.004;对照vs C5,<0.001)这是由于蓝藻菌群由于具有保持水分的能力从而更能适应更高强度干旱的恶劣环境[45].

在科水平上对生物膜内微生物群落进行物种分析(图4b),与对照相比,C1、C3和C5处理中腐螺旋菌科(Saprospiraceae)相对丰度降低是拟杆菌门显著减少的原因,腐螺旋菌科已被证实是降解有机物的主要菌群[46-47],因此干旱胁迫时营养物质(碳源、氮源)的减少可能导致腐螺旋菌科相对丰度的降低,且干旱胁迫越大,该菌丰度降低越显著(<0.001).此外,C3和C5组中细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae)相对丰度增加是蓝藻菌门显著增加的主要原因,细鞘丝藻亚科中的瘦鞘丝藻属()被认为是干燥环境中的优势属[48],因此,经干湿交替循环后生物膜内形成了不同的菌群.

图4 生物膜物种的相对丰度(a)门水平,(b)科水平

为进一步研究干湿交替循环频率对微生物群落的影响,在种水平上开展了指示物种分析(图5a),结果显示,不同干湿交替循环频率下种水平指示物种不同.具体而言,在对照处理中的指示物种为自养黄色杆菌()、玫瑰色帝国杆菌()和甲基杆菌();C1处理中指示物种为墨西哥微小杆菌()和奇异球菌(),而C5处理中的指示物种为纤发鞘丝蓝细菌()和浮霉菌().通过FAPROTAX数据库对微生物进行功能注释时发现,在对照、C1和C3生物膜中主要存在Chemoheterotrophy和Aerobic chemoheterotrophy等化能异养功能(图5b).而在较高干湿交替循环频率(C5)下,生物膜中主要存在Phototrophy、Oxygenic photoautotrophy、Photoautotrophy和Cyanobacteria等光能自养功能.类似地,其他学者也发现光自养群落在应对持续干旱时表现出多种抗性策略[16, 49-50].

图5 (a)种水平指示物种分析,(b)生物膜的功能丰度

2.2.2 不同干湿交替循环频率下微生物群落结构的和多样性分析多样性采用Sobs、Shannon、Chao1和ACE等指数来衡量(表1),数值越大,表明微生物群落的丰富度和多样性越高.与对照组相比,C1、C3和C5组的丰富度和多样性指数均显示出整体的下降趋势,尤其是当干湿交替循环频率过高时,生物膜内Shannon指数的降低最为显著(C3,=0.012; C5,=0.02).可见,经干湿交替循环处理后,生物膜内微生物群落多样性和丰富度会降低.

表1 不同干湿交替循环频率下生物膜的Sobs, Shannon, Chao1, ACE指数

注:*< 0.05;1Sobs:观察到的物种数量(OTUs).

多样性分析使用基于Bray-Curtis距离进行的非度量多维尺度(NMDS)分析(图6),结果显示,经干湿交替循环后生物膜内菌群在NMDS图中具有明显的成簇聚集现象,且相似性分析ANOSIM进一步证实四组之间的显著差异(=0.001),该结果表明不同干湿交替循环频率对生物膜内微生物群落的多样性有显著影响,且当干湿交替循环频率过高(C5)时,生物膜内微生物群落差异更大.

图6 基于Bray-Curtis差异的NMDS

2.3 生物膜对干湿交替循环潜在的抵抗和恢复机制

栖息在间歇性河流生物膜中的微生物群落会使用多种抗性机制来使他们能在不利的环境条件下生存,比如生物膜内的异质组合由于其三维空间和一致性可防止干燥,且可作为捕获生物膜基质中营养物质和有机物的关键点而有利于微生物群落的生存[51].在本研究中我们发现,一定程度干湿交替循环频率(C3)下生物膜内微生物群落EPS含量增加,这得益于EPS 层可增强水合作用来缓冲细胞使其抵抗中度干燥[52-53].在不同处理(C1、C3和C5)的干湿交替循环频率下,均观察到群落丰富度和多样性的降低,这是由于生物膜会通过降低微生物群落多样性,同时增加抗旱菌群来抵抗干旱.其中,C1和C3处理下变形菌门丰度增加,变形菌已被证实具有一定的抗干燥能力[43],而当干湿交替循环频率过高(C5)时,与蓝藻相关的细菌成为优势菌,使其在高频率干湿交替循环下生存并成为优势菌,一方面是由于蓝藻菌群具有保持水分的能力[45],另一方面是由于此类菌群会通过休眠来抵抗干燥[54].此外,我们还发现,当干湿交替循环频率过高(C5)时,生物膜功能由原来的化能异养功能转变为光能自养功能,这是由于光能自养群落能在应对持续干旱时表现出抗性[47].且指示物种分析结果表明,不同频率的干湿交替循环下的菌群有所不同,且没有恢复到初始状态,这正如Marxsen等[55]所报道的那样,干湿交替循环造成的细胞死亡和持久损害降低了微生物群落丰富度、多样性及其代谢潜力.以上结果表明,当微生物群落受到较低频率干湿交替循环 (C1)时,其结构和功能会维持原状,表现为抵抗力,而随着干湿交替循环频率的增加(C3),微生物群落的结构会发生改变,且当干湿交替循环频率超过生物膜耐受程度时,其结构和功能均会发生改变,并使其达到一种新的稳定状态来构建其耐旱机制,即表现为恢复力.

3 结论

3.1 干湿交替循环频率对生物膜形态结构的影响主要表现在生物膜厚度、EPS含量和活/死菌比例这几个方面,而生物膜的比表面积和粗糙度系数无显著性变化.具体而言,与对照相比,生物膜厚度随干湿交替循环频率的增加而显著减少了4.57µm(< 0.05).EPS含量在干湿交替循环频率较低(C1)时减少了0.75µm3/µm3,这是由于生物膜内微生物群落会通过消耗自身EPS内的碳水化合物来维持其维持新陈代谢,随着干湿交替循环频率的增加(C3),生物膜通过增加2.51µm3/µm3的EPS含量来保护细菌免受脱水的伤害,生物膜内活/死菌比例相应增大了1.09,而当干湿交替循环频率超过生物膜耐受程度(C5)时,大量微生物死亡,生物膜内活/死菌比例下降了2.89,从而导致EPS的剧烈减少2.86µm3/µm3(< 0.05).

3.2 干湿交替循环频率对生物膜内微生物种群结构、多样性和功能的影响主要表现在不同干湿交替循环频率(C1、C3和C5)下生物膜内形成了不同的优势菌群,指示物种发生改变,群落丰富度和多样性降低.在较低干湿交替循环频率(C1和C3)下,生物膜功能没有发生改变,均表现为以化能异养功能为主,而当干湿交替循环频率超过生物膜耐受程度(C5)时,生物膜功能表现为以光能自养功能为主.

3.3 在低频率干湿交替循环(C1)下,生物膜内微生物群落的生存策略以抵抗力为主,优势菌为具有抵抗干燥能力的变形菌;而随着干湿交替循环频率的增加(C3),生物膜内出现明显的团聚现象,结构发生改变,且当干湿交替循环频率超过生物膜耐受程度(C5)时,生物膜中出现大量丝状藻类,优势菌由变形菌转变为与蓝藻相关的细菌群落,这是因为与蓝藻相关的细菌不仅具有保持水分的能力,而且可通过休眠阶段来抵抗干燥,并且在高频率干湿交替循环下生物膜功能发生改变,这表明在高频率干湿交替循环下生物膜内微生物群落的生存策略以恢复力为主.

[1] Datry T, Larned S T, Tockner K. Intermittent Rivers: A challenge for freshwater ecology [J]. Bioscience, 2014,64(3):229-235.

[2] Corti R, Datry T. Terrestrial and aquatic invertebrates in the riverbed of an intermittent river: parallels and contrasts in community organisation [J]. Freshwater Biology, 2016,61(8):1308-1320.

[3] Datry T, Fritz K, Leigh C. Challenges, developments and perspectives in intermittent river ecology [J]. Freshwater Biology. 2016,61(8): 1171-1180.

[4] Ylla I, Sanpera-Calbet I, Vazquez E, et al. Organic matter availability during pre- and post-drought periods in a Mediterranean stream [J]. Hdrobiologia, 2010,657(1):217-232.

[5] Fazi S, Vazquez E, Casamayor E O, et al. Stream hydrological fragmentation drives bacterioplankton community composition [J]. Plos One, 2013,8(5):0064109.

[6] Tzoraki O, Nikolaidis N P, Amaxidis Y, et al. In-stream biogeochemical processes of a temporary river [J]. Environmental Science & Technology, 2007,41(4):1225-1231.

[7] Barthès A, Ten-Hage L, Lamy A, et al. Resilience of aggregated microbial communities subjected to drought—small-scale studies [J]. Microbial Ecology, 2015,70(1):9-20.

[8] Flemming H, Wingender J. The biofilm matrix [J]. Nature Reviews Microbiology, 2010,8(9):623-633.

[9] Weaver L, Webber J B, Hickson A C, et al. Biofilm resilience to desiccation in groundwater aquifers: a laboratory and field study [J]. Science of The Total Environment, 2015,514:281-289.

[10] 周 新,张 伟,崔 鸿.生态系统的抵抗力和恢复力稳定性[J]. 生物学教学, 2014,39(4):4-5.

Zhou X, Zhou W, Cui H, et al. Resistance and resilience stability of ecosystem [J]. Biology Teaching, 2014,39(4):4-5.

[11] 何红英.对"生态系统抵抗力稳定性和恢复力稳定性"的辨析[J]. 中学生物学, 2013,29(3):3-4.

He H Y. Analysis of "Ecosystem resistance and resilience stability" [J]. Middle School Biology, 2013,29(3):3-4.

[12] 李超然,苗令占,侯 俊.间歇性河流中生物膜对干湿胁迫的动态响应 [J]. 中国环境科学, 2021,41(11):5245-5253.

Li C R, Miao L Z, Hou J, et al. Dynamic response of biofilm to dry and wet stress in intermittent rivers [J]. China Environmental Science, 2021,41(11):5245-5253.

[13] Mckew B A, Taylor J D, Mcgenity T J, et al. Resistance and resilience of benthic biofilm communities from a temperate saltmarsh to desiccation and rewetting [J]. ISME J, 2011,5(1):30-41.

[14] Febria C M, Beddoes P, Fulthorpe R R, et al. Bacterial community dynamics in the hyporheic zone of an intermittent stream [J]. ISME J, 2012,6(5):1078-1088.

[15] Timoner X, Acuna V, Frampton L, et al. Biofilm functional responses to the rehydration of a dry intermittent stream [J]. Hydrobiologia, 2014,727(1):185-195.

[16] 宋云龙,张金松,朱 佳,等.基于高通量测序的微生物强化污泥减量工艺中微生物群落解析[J]. 中国环境科学, 2016,(7):2099-2107.

Song Y L, Zhang J S, Zhu J, et al. Analysis of microbial community in microbial enhanced sludge reduction process based on high- throughput sequencing [J]. China Environmental Science, 2016,(7): 2099-2107.

[17] Zlatanović S, Fabian J, Premke K, et al. Shading and sediment structure effects on stream metabolism resistance and resilience to infrequent droughts [J]. Science of The Total Environment, 2018, 621:1233-1242.

[18] Acuña V, Casellas M, Corcoll N, et al. Increasing extent of periods of no flow in intermittent waterways promotes heterotrophy [J]. Freshwater Biology, 2015,60(9):1810-1823.

[19] Luo X, Yang Y H, Xie S S, et al. Drying and rewetting induce changes in biofilm characteristics and the release of metal ions [J]. Journal of Hazardous Materials, 2022,433:128832.

[20] Romaní A M, Vázquez E, Butturini A. Microbial availability and size fractionation of dissolved organic carbon after drought in an intermittent stream: biogeochemical link across the stream–riparian interface [J]. Microbial Ecology, 2006,52(3):501-512.

[21] Mckew B A, Taylor J D, Mcgenity T J, et al. Resistance and resilience of benthic biofilm communities from a temperate saltmarsh to desiccation and rewetting [J]. The ISME Journal, 2011,5(1):30-41.

[22] Gonzalez A G, Mombo S, Leflaive J, et al. Silver nanoparticles impact phototrophic biofilm communities to a considerably higher degree than ionic silver [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2015,22(11):8412-8424.

[23] Luo X, Xiang X Y, Huang G Y, et al. Bacterial abundance and physicochemical characteristics of water and sediment associated with hydroelectric dam on the Lancang River China [J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2019,16(11):2031.

[24] Luo X, Jedlicka S, Jellison K. Pseudo-second-order calcium- Mediated Cryptosporidium parvum oocyst attachment to environmental biofilms [J]. Appled and Environmental Microbiology, 2017,83(1):02339-16.

[25] Luo X, Jedlicka S S, Jellison K L. Role of wall shear stress in Cryptosporidium parvum oocyst attachment to environmental biofilms [J]. Appled and Environmental Microbiology, 2017,83(24):01533-17.

[26] Wunder D B, Bosscher V A, Cok R C, et al. Sorption of antibiotics to biofilm [J]. Water Research, 2011,45(6):2270-2280.

[27] Luo X, Jellison K L, Huynh K, et al. Impact of bioreactor environment and recovery method on the profile of bacterial populations from water distribution systems [J]. Plos One, 2015,10(7):e0133427.

[28] Garny K, Neu T R, Horn H, et al. Combined application of C-13NMR spectroscopy and confocal laser scanning microscopy-Investigation on biofilm structure and physico-chemical properties [J]. Chemical Engineering Science, 2010,65(16):4691-4700.

[29] Neu T R, Woelfl S, Lawrence J R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation) [J]. Journal of Microbiological Methods, 2004,56(2):161-172.

[30] Heydorn A, Nielsen A T, Hentzer M, et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program Comstat [J]. Microbiology- SGM, 2000,146:2395-2407.

[31] Onay E O, Alikaya C, Seker E. Evaluation of antifungal efficacy of erbium, chromium: Yttrium-Scandium-Gallium-Garnet laser against Candida albicans [J]. Photomedicine and Laser Surgery, 2010, 28:S73-S78.

[32] Edgar R C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads [J]. Nature Methods, 2013,10(10):996.

[33] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 2010,7(5):335-336.

[34] Pruesse E, Quast C, Knittel K, et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB [J]. Nucleic Acids Research, 2007,35(21): 7188-7196.

[35] Wickham H, Chang W. ggplot2: an implementation of the grammar of graphics [J]. R package version 0.7, URL: http://CRAN. R-project. org/package= ggplot2, 2008,3.

[36] Oksanen J, Blanchet FG, Kindt R, et al. Vegan: community ecology package [M]. R package version 1.17-4, URL: http://cran. r-project. org>. Acesso em, 2010,23:2010.

[37] Roberts D. labdsv: Ordination and Multivariate Analysis for Ecology [M]//2013.

[38] Louca S, Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global ocean microbiome [J]. Science, 2016,353(6305):1272- 1277.

[39] Naseem H, Ahsan M, Shahid M A, et al. Exopolysaccharides producing rhizobacteria and their role in plant growth and drought tolerance [J]. Journal of Basic Microbiology, 2018,58(12):1009-1022.

[40] Zhou H, Sheng Y, Zhao X, et al. Treatment of acidic sulfate- containing wastewater using revolving algae biofilm reactors: Sulfur removal performance and microbial community characterization [J]. Bioresource Technology, 2018,264:24-34.

[41] Schimel J, Balser T C, Wallenstein M. Microbial stress-response physiology and its implications for ecosystem function [J]. Ecology, 2007,88(6):1386-1394.

[42] Ustunturk-Onan M, Hoca S, Ilhan-Sungur E. The Effect of Short-Term Drying on Biofilm Formed in a Model Water Distribution System [J]. Microbiology, 2018,87(6):857-864.

[43] Amalfitano S, Fazi S, Zoppini A, et al. Responses of benthic bacteria to experimental drying in sediments from Mediterranean temporary rivers [J]. Microbial Ecology, 2008,55(2):270-279.

[44] Bu X, Gu X, Zhou X, et al. Extreme drought slightly decreased soil labile organic C and N contents and altered microbial community structure in a subtropical evergreen forest [J]. Forest Ecology and Management, 2018,429:18-27.

[45] Fuentes E, Prieto B. Recovery capacity of subaerial biofilms grown on granite buildings subjected to simulated drought in a climate change context [J]. Microbial Ecology, 2021,82(3):761-769.

[46] 黄 兴,孙宝盛,孙井梅,等.贫营养条件下EPS、SMP和微生物多样性的研究 [J]. 环境科学, 2009,30(5):1468-1474.

Huang X, Sun B S, Sun J M, et al. EPS, SMP and Microbial Biodiversity Under the Oligotrophic Environment [J]. Environmental Science, 2009,30(5):1468-1474.

[47] Guo Y, Peng Y, Wang B, et al. Achieving simultaneous nitrogen removal of low C/N wastewater and external sludge reutilization in a sequencing batch reactor [J]. Chemical Engineering Journal, 2020, 306:925-932.

[48] Santos F, Pena A, Nogales B, et al. Bacterial diversity in dry modern freshwater stromatolites from Ruidera Pools Natural Park, Spain [J]. Systematic and Applied Microbiology, 2010,33(4):209-221.

[49] 李 军,张翠云,蓝芙宁,等.区域地下水不同深度微生物群落结构特征 [J]. 中国环境科学, 2019,(6):2614-2623.

Li J, Zhang C Y, Lan F N, et al. Characteristics of microbial community structure in different depths of regional groundwater [J]. China Environmental Science, 2019,(6):2614-2623.

[50] 金梦婷,朱 亮,朱 彧,等.城市缓流水体生物膜群落与环境因子响应关系 [J]. 湖泊科学, 2015,27(1):58-66.

Jin M T, Zhu L, Zhu Y, et al. Relationship between biofilm community and environmental factors in urban slow-flow water [J]. Journal of Lake Sciences, 2015,27(1):58-66.

[51] Battin T J, Besemer K, Bengtsson M M, et al. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms [J]. Nature Reviews Microbiology, 2016,14(4):251-263.

[52] Or D, Phutane S, Dechesne A. Extracellular polymeric substances affecting pore-Scale hydrologic conditions for bacterial activity in unsaturated soils [J]. Vadose Zone Journal, 2007,6(2):298-305.

[53] Romaní A M, Amalfitano S, Artigas J, et al. Microbial biofilm structure and organic matter use in mediterranean streams [J]. Hydrobiologia, 2013,719(1):43-58.

[54] Sabater S, Timoner X, Bornette G, et al. The Biota of intermittent rivers andephemeral streams: algae and vascular plants [J]. Intermittent Rivers and Ephemeral Streams, 2017:189-216.

[55] Marxsen J, Zoppini A, Wilczek S. Microbial communities in streambed sediments recovering from desiccation [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2010,71(3):374-386.

Effects of alternate drying-wetting cycles on biofilm characteristics and their microbial communities.

LI Chun-yan1,2, XIE Shan-shan1,2, WANG Wen-wen1,2, ZHU Shi-jun1,2, WEN Chen1,2, LI Ni-hong1,2, LUO Xia1,2*

(1.Institute of International Rivers and Eco-Security, Yunnan University, Kunming 650500, China；2.Yunnan Key Laboratory of International Rivers and Transboundary Eco-Security, Kunming 650500, China)., 202343(2)：854～862

The periphytic biofilm was sampled in natural environment and cultivated under indoor controlled conditions to clarify the biofilm resistance mechanisms under the influence of alternate drying and wetting cycles. The morphology, microbial community structure, diversity and function of natural biofilms were examined using 16S rRNA gene high throughput sequencing and confocal laser scanning microscopy. The results showed that biofilm thickness was reduced from 9.10 to 6.46 µm with the increase of alternate drying-wetting cycles from one (C1) to five (C5). The extracellular polymer content decreased from 2.64 μm3/μm3(control) to 1.9 μm3/μm3(C1), and then increased from 4.41 μm3/μm3(C3) to 1.54 μm3/μm3(C5,=0.004). The ratio of live/dead bacteria increased from 2.52 (C1) to 3.60 (C3), and then decreased to 0.72(C5,=0.009). However, the changes in surface area to volume ration and roughness coefficient with the alternate drying and wetting cycles were not significant compared to the control. In contrast to the control, the richness and diversity of the microbial community decreased and the indicator species changed when biofilm exposed to alternate drying and wetting cycles. The dominant bacteria in biofilm shifted from Proteobacteria to Cyanobacteria-related flora when the alternate drying and wetting cycles reached to five (C5). Moreover, functional groups associated with photoautotrophy became the most abundant. Therefore, biofilm morphology and microbial community structure were associated with the alternate drying and wetting cycles. Microbial communities exhibited high degrees of resistance under lower alternate drying and wetting cycles, whereas showed high degrees of resilience to increased alternate drying and wetting cycles.

alternate drying-wetting cycles；biofilm；microbial community；resistance；resilience

X172

A

1000-6923(2023)02-0854-09

李春艳(1997-)女,云南省昭通人,云南大学硕士研究生,主要从事环境污染监测和修复研究.

2022-07-11

国家自然科学基金资助项目(42167053,41807472);云南省基础研究计划优秀青年项目(202001AW070020);云南省千人计划“青年人才”项目(YNQR-QNRC-2018-123,C619300A019)

* 责任作者, 副研究员, luoxia@ynu.edu.cn