清肺通络合剂对气阴两虚兼痰热型社区获得性肺炎患者肠道菌群多样性的影响

翁卫东 饶先林 陆峰彬 金 燕 柴可群

中药清肺通络合剂（Qingfeitongluo Mixture，QFTLM）是浙江省立同德医院内制剂，适用于热病后期气阴两虚兼余毒未清型患者，具有益气养阴、清肺化痰的功效。以往在治疗社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）恢复期气阴两虚兼痰热型患者中发现，该方能显著降低临床证候积分[1]。为明确其疗效作用机制，本研究从肠道菌群进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020 年6 月至2021 年6 月浙江省立同德医院感染科气阴两虚兼痰热型CAP 住院患者23 例，其中男11 例，女12 例；年龄23～60（38.26±9.65）岁；病程1～5（3.10±1.29）d。本研究经患者知情同意并通过医院伦理委员会审核批准（KTSC2021226）。

1.2 纳入标准 （1）CAP 西医诊断标准符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》[2]；（2）CAP 中医辨证分型标准参考《社区获得性肺炎中医诊疗指南（2018 修订版）》[3]，气阴两虚兼痰热型主症：发热、咳嗽，无痰或少痰，口干，气短，乏力，舌红，苔少或薄，脉细数；次症：咳痰不爽，纳差，自汗，盗汗，手足心热，大便干、尿短赤。具备发热、咳嗽及其他主症或次症2 项即可诊断；（3）年龄18～60 周岁；（4）体质指数18～25 kg/m2；（5）3 个月内未使用抗生素、益生菌、糖皮质激素、质子泵抑制剂及中草药等；（6）无饮酒等特殊嗜好；（7）无严重慢性疾病史。

1.3 排除标准 （1）新型冠状病毒感染；（2）流行性感冒；（3）重症肺炎；（4）使用研究以外的药物；（5）近期有急性胃肠炎或腹泻；（6）妊娠或哺乳的妇女；（7）临床资料不全或自依从性差者。

1.4 分组方法 采用前瞻性临床对照研究方法，根据患者治疗方法的不同，将23 例气阴两虚兼痰热型CAP 患者分为两组：抗菌药物治疗组10 例；抗菌药物联合QFTLM 治疗组13 例。收集患者治疗前（入院0～1 d）和治疗1 周后（入院7～8 d）粪便样本46 份，其中抗菌药物组治疗前后各10 份，抗菌药物联合QFTLM组治疗前后各13 份。

1.5 药物选择

1.5.1 抗菌药物 （1）头孢噻肟钠注射液2.0 g 静脉滴注，每8 h1 次（山东罗欣药业集团股份有限公司，批号322037034）联合左氧氟沙星片0.5 g 口服，每天1 次（第一制药北京有限公司，批号BY075G1）；（2）派拉西林/他唑巴坦注射液4.5 g 静脉滴注，每8 h1次（瀚晖制药有限公司，批号22013111）联合左氧氟沙星片0.5 g 口服每天1 次。

1.5.2 QFTLM 由医院制剂室制备（备案号：浙药制备字Z20200045000，批号200716、210203、210208、210427、210429、210505），每瓶500 mL（每1 mL 相当于饮片0.724 g），口服，1 天2 次，每次125 mL。组方：太子参、南沙参、茯苓各15 g，炒白术、桑白皮各12 g，芦根20 g，桔梗6 g，广地龙9 g，丹参15 g，薏苡仁30 g，冬瓜子12 g，姜半夏9 g，砂仁（后下）5 g，甘草6 g。

1.5.3 合并用药 体温≥39.0 ℃可予吲哚美辛肛栓50 mg 塞肛，24 h 不超过100 mg。

1.6 检验方法 收集患者新鲜粪便约1 g 置于无菌试管中，立刻予-80 ℃冰箱保存，统一冷运至北京百迈客生物科技有限公司，经DNA 提取、PCR 扩增、纯化、混样、PE 文库制备，上机PacBio 平台进行16S rRNA 测序（V1-V9 区），下机数据经过滤、拼接、按97%相似性划分操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，根据聚类结果，对每个OTU 的代表序列做物种注释，得到对应的物种及丰度信息。通过α 多样性分析明确样本内物种丰富度和均匀度；通过β 多样性分析明确组间群落结构差异；通过组间显著性差异物种分析明确各组特异性物种。

1.7 统计学方法 应用生物信息学统计分析方法，测序结果在百迈客生物信息云平台（https://international.biocloud.net/zh/dashboard）上完成。符合正态分布的数据用均数±标准差（）表示；α 多样性分析采用独立样本t 检验；β 多样性分析采用主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）；组间差异显著性分析采用方差分析和线性判别分析[line discriminant analysis（LDA）effect size，LEfSe]。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序数据结果分析 46 个样本共获得337542条有效序列，平均读长1438～1473 bp，共鉴定出320个OTU，在各分类学水平共鉴定出10 个门、18 个纲、40 个目、68 个科、172 个属和266 个种。以样本稀释性曲线（Multy samples Rarefaction Curves）（见图1）判断各样本测序量是否充分，当曲线急剧上升表明测序量不足，反之则表明样品序列充分。

图1 样本稀释性曲线

2.2 两组CAP 患者治疗前后相对丰度大于1%的菌群组成 在门水平为厚壁菌门、变形杆菌门、拟杆菌门、疣微菌门和放线菌门；在纲水平为梭菌纲、革兰阴性菌纲、芽孢杆菌纲、丹毒丝菌纲、拟杆菌纲、γ-变形杆菌纲、疣微菌纲和放线菌纲；在目水平为拟杆菌目、梭菌目、单胞菌目、肠杆菌目、乳杆菌目、丹毒丝菌目和颤螺菌目；在科水平为拟杆菌科、乳球菌科、肠杆菌科、韦荣球菌科、艾克曼菌科、毛螺菌科、喜热菌科、链球菌科、丹毒丝菌科和肠球菌科；在属水平为拟杆菌属、粪杆菌属、埃希氏菌属、罕见小球菌属、巨单胞菌属、艾克曼菌属、梭菌属、链球菌属和肠球菌属。

2.3 肠道菌群多样性分析

2.3.1 α 多样性分析 α 多样性指数差异柱状图（见图2），抗菌药物组治疗前后Ace 指数分别为（96.40±9.56）比（63.33±7.56）（P<0.05）（见图2a），PD_whole_tree 指数分别为（6.43±0.56）比（4.63±0.55）（P<0.05）（见图2b）；抗菌药物联合QFTLM 组治疗前后Shannon 指数分别为（3.82±0.27）比（2.79±0.40）（P<0.05）（见图2c）。提示两组治疗后α 多样性较治疗前明显减少。

图2 α 多样性指数差异柱状图

2.3.2 β 多样性分析 PCoA 分析图（见图3）中未见样本显著分离，采用Weight UniFrac 计算法第一主成分（The first principal component，PC1）贡献率为30.74%。提示组间β 多样性差异不显著。

图3 PCoA 分析图

2.4 肠道菌群差异显著性分析

2.4.1 两组治疗前后肠道菌群相对丰度的方差分析

组间方差分析柱状图（见图4），其中梭菌纲的相对丰度抗菌药物组治疗前后分别为（0.48±0.24）比（0.17±0.14）（P<0.01）；抗菌药物联合QFTLM 组治疗前后分别为（0.42±0.20）比（0.17±0.15）（P<0.05）。提示两组治疗后梭菌纲的相对丰度较治疗前显著减少。

图4 组间方差分析柱状图

2.4.2 两组治疗前后显著性差异物种分析 LDA 值分布柱状图（见图5），抗菌药物组治疗前显著性差异物种为厚壁菌门、梭菌纲、梭菌目和瘤胃球菌属，治疗后为链球菌科、链球菌属和唾液链球菌种（见图5a）；抗菌药物联合QFTLM 组治疗前显著性差异物种为梭菌纲、梭菌目、瘤胃球菌科和毛螺菌科，治疗后为肠球菌科、肠球菌属、鸟肠球菌种和多形拟杆菌种（见图5b）。提示两组治疗前显著性差异物种均为梭菌而治疗后出现不同变化。

图5 LDA 值分布柱状图

3 讨论

CAP 是常见病、多发病，是患者死亡的常见病因[4]。“肠-肺轴”概念的提出[5-6]，为研究CAP 提供了新的思路。“肠-肺轴”是指肺与肠共用一个黏膜免疫系统，通过其间的微生物对机体免疫产生相互作用和影响。肠道菌群作为其间双向交流的重要物质，影响着呼吸系统的免疫功能和疾病的预后[7-8]。CAP 相关研究发现，致病微生物通过与呼吸道靶细胞的受体结合进入人体引发肺部炎症，也与消化道具有相同受体的靶细胞结合破坏肠道菌群，导致细菌及其代谢产物进入循环而激活全身炎症反应[9]。抗菌药物是治疗CAP 的常用手段，但细菌耐药和肠道菌群失调等问题，严重降低了其临床疗效[10-11]。中药具有调节肠道微生态和抗感染等多种作用[12-14]，中西医结合可以取长补短提高临床疗效[15]。

CAP 多属中医“风温肺热病”范畴，常由外邪侵袭，肺卫受邪或正气亏虚，抗邪无力，致风热邪毒袭肺或风寒之邪入里化热，炼津为痰，痰热壅肺，肺失宣降。因热邪极易耗气伤阴，故风温肺热病早期即可见气阴两虚兼痰热证候。中医认为，肺与大肠相表里、脾与肺是母子相生关系，从辨证论治的整体观出发，中医治疗肺病不局限于肺，常从脾胃肠入手，在清肺化痰等驱邪基础上联合健脾益气养阴等治疗方法。针对风温肺热病的特点，中医强调应尽早益气养阴以保存阴津、顾护正气。QFTLM 基于上述理论组方，方中太子参补肺脾之气，南沙参补肺胃之阴，茯苓、白术、米仁健脾化湿，桑白皮、桔梗清泻肺火、祛痰平喘，姜半夏燥湿化痰、降逆止咳，芦根清热生津、祛痰排脓，冬瓜子清肺化痰、利湿排脓，丹参、地龙凉血散瘀、活血通络，砂仁化湿和胃，甘草调和诸药。本研究选择气阴两虚兼痰热型CAP 患者为研究对象，与以往在热病后期使用QFTLM 不同，本研究在CAP早期即与抗菌药物联合使用，与单用抗菌药物治疗的患者比较肠道菌群多样性的变化，以明确QFTLM对肠道菌群的影响。研究结果显示，气阴两虚兼痰热型CAP 患者经抗菌药物治疗1 周，肠道菌群α 多样性明显减少，显著性差异物种由梭菌变为链球菌。QFTLM 无法完全改变这种肠道菌群α 多样性减少，但可将显著性差物种由梭菌改变为肠球菌和多形拟杆菌。肠球菌和多形拟杆菌是肠道中重要的菌群，在正常人体肠道中对健康有益，肠球菌能产生天然的抗生素起到抑菌作用[16]，多形拟杆菌是降解碳水化合物的优秀细菌，能加快食物中多糖的消化吸收[17]。由此推测，QFTLM 可能是通过增加肠道中对人体有益的细菌和加快食物中碳水化合物的消化吸收来促进患者临床证候积分的改善。