不同频率电针介导PINK1/Parkin 通路治疗STC 模型大鼠的机制研究

吴姝雯 刘 敏 楼毅杰 崔宇胜 刘承浩

慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是临床常见的便秘类型，占16%～40%[1]。电针“后三里”穴位可改善肠易激综合征便秘大鼠结肠肌间神经丛的可塑性，推测该方法有助于治疗便秘[2]。而STC 结肠肌间神经丛病理改变，以结肠Cajal 间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）神经丛及突起分支减少、细胞网络损毁为典型表现[3]。在STC 中线粒体自噬相关蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten-in-duced kinase 1，PINK1）/帕金蛋白（Parkin protein，Parkin）通路被激活，PINK1、Parkin、自噬效应蛋白1（Beclin-1，Beclin1）、自噬相关蛋白3（light chain 3，LC3）表达升高，而原癌基因（C-kit）、p62 表达下降，导致ICC 细胞自噬增多、ICC 细胞减少[4]。本研究拟探讨电针对STC 的作用与机制。

1 实验材料

1.1 动 物 8 周龄雄性健康SD 大鼠34 只，体质量200～250 g，购自上海加科生物科技有限公司，许可证号：SCXK（沪）2020-0001。饲养条件依据清洁级要求，饲养室温度保持在20～25 ℃，相对湿度50%～65%。饲养室采用光照定时装置，提供适当的（12 h光照，12 h 黑暗）昼夜光变化周期，均予啮齿动物标准颗粒饲料和饮水。本研究经浙江中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（院准字202004-001）。

1.2 试剂洛哌丁胺（上海华氏制药有限公司第十五制药厂，批号20020913）；墨汁（德国DOKUMENTAL 公司）；10%活性炭悬液（河南中聚净化材料有限公司，批号20201014）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号190516）；电镜固定液、锇酸溶液、醋酸铀水溶液、甲苯胺兰、柠檬酸铅、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液、细胞裂解液、电化学发光液（美国Sigma 公司，批号20200304、20191215、20200117、20200225、20191214、20200311）；内源性过氧化物酶（武汉博士德生物技术有限公司，批号R1911178）；兔抗鼠C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体（一抗，Abcam 中国公司，批号190816、190913、190925、190611、191014、191207、191105），羊抗兔C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3、GAPDH 多克隆抗体（过氧化物酶标记）（二抗，Abcam 中国公司，批号190904、191025、191018、190803、191025、191217、191223）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（美国Bio-rad 公司，批号20191004）。

1.3 仪器 HL-DXG 型大鼠固定架（北京合力科创科技发展有限公司）；一次性针灸针（吴江市佳辰针灸器械有限公司，0.25 mm×25 mm）；SDZ-IIB 型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；500 型游标卡尺（上海九量五金工具有限公司）；RM2235 型组织切片机（德国Leica 公司）；PowerTome-XL 型超薄切片机（美国RMC 公司）；CX31 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；EVOS M5000 型免疫荧光共聚焦显微镜（美国Thermo 公司）；T10 型组织匀浆机（德国IKA 公司）；Image Pro-plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司）；DYCA 24F 蛋白质凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；170-3940 型转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；SC 320 型摇床（上海达姆实业有限公司）。

2 实验方法

2.1 建模方法 将34 只SD 大鼠采用随机数字表分为正常对照组7 只和建模组27 只。建模组采用洛哌丁胺混悬液灌胃法制备STC 模型大鼠[5]，剂量3.0 mg/kg，正常对照组同时灌胃等量无菌生理盐水，均每天1 次，连续6 d。末次灌胃结束，均灌胃2 mL 墨汁，自由饮水6 h，记录建模组与正常对照组首粒黑便排出时间，即从墨汁灌胃结束到首粒黑便排出时间间隔，若建模组首粒黑便排出时间较正常对照组显著延长，则认为建模成功[6]。于建模组、正常对照组中各随机处死1 只大鼠暴露肠管、分离肠系膜，将回盲部上端与直肠末端结扎并剪断肠管，取出大肠后轻拉成直线，剖开盲肠至直肠的肠系带观察粪便残留情况，计算大肠碳素墨汁推进率，即大肠内墨汁推进距离/大肠全长×100.00%。

2.2 分组及干预方法 验证STC 建模成功后将模型组剩余存活大鼠采用随机数字表分为模型对照组8 只、2 Hz 电针组6 只、50 Hz 电针组6 只、假电针组6 只，正常对照组剩余6 只存活大鼠。“后三里”定位于胫骨平台下方3 寸（约6.87 mm），在胫骨前缘外侧约4.5 mm、腓骨头尖下方0.84 mm 并向前约3.35 mm处，进针角度与胫骨前缘矢状面呈45°，深度约6 mm。在“后三里”下约2 mm 刺入另一毫针作为参考电极（接负极），“后三里”穴位接正极。2 Hz 电针组予以电子针疗仪频率2 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”，50 Hz 电针组予以电子针疗仪频率50 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”，假电针组针刺“后三里”但电子针疗仪不通电，模型对照组和正常对照组仅固定处理，每天30 min，每天1 次，持续14 d。

2.3 肠道推进率比较 各组大鼠分别于干预14 d后禁食不禁水24 h，灌服10%活性炭悬液2 mL，40 min 后脱臼法处死。参照1.2.1 中方法取出全段肠管，计算肠道推进率，即活性炭前端至幽门的距离/幽门至直肠末端总长度×100.00%。

2.4 结肠组织病理改变、ICC 形态观察 生理盐水冲洗大鼠结肠内容物，分装于37%的甲醛溶液中，固定后梯度浓度乙醇脱水透明（100%→95%→90%→80%→70%，其中每级脱水2～3 min）、石蜡包埋、连续切片（层厚4 μm），以二甲苯溶液脱蜡、酒精溶液水化，苏木精染色后盐酸酒精分化，伊红复染，脱水、封片、光学显微镜下观察。另取1 mm×1 m×1 mm 结肠组织标本分别置于电镜固定液、锇酸溶液中固定，饱和醋酸铀水溶液中避光染色，脱水、干燥后纯环氧丙烷处理，包埋后制作超薄切片（层厚0.2～0.4 μm）。甲苯胺兰染色，再次切片（层厚50～60 nm），加入饱和醋酸铀水溶液，室温避光10 min；柠檬酸铅染色，5 min后免疫荧光共聚焦显微镜观察ICC 形态并分析积分光密度（integrated optical density，IOD）。

2.5 结肠组织C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表达检测 采用蛋白质免疫印迹（Westernblot，WB）法：取大鼠结肠组织研磨匀浆，细胞裂解液裂解，提取总蛋白并以BCA 试剂盒定量。30 μg 蛋白电泳，转至聚偏氟乙烯膜，转印时间35～40 min。冲洗后37 ℃封闭2 h，滴加一抗（稀释倍数均1∶2000），4 ℃孵育过夜，冲洗3 次，剧烈洗涤；滴加二抗（稀释倍数均1∶3000），冲洗3 次并剧烈洗涤。电化学发光法显影，以GAPDH 为内参，检测蛋白条带灰度×面积/（内参条带灰度×面积）即为蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法 应用SPSS 21.0 软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 建模、分组情况及各组大鼠干预后肠道推进率比较 建模组大鼠6 d 后均出现活动减少、食量减少、毛发色泽暗淡且枯萎脱落、大便数量减少等表现，正常对照组大鼠活动、食量、大便均正常，毛发有光泽且浓密。建模组大鼠首粒黑便排出时间为306～418（355.67±42.05）min；正常对照组大鼠首粒黑便排出时间为215～297（261.34±34.45）min。建模组较正常对照组显著延长（t=46.753，P＜0.001），证实STC 大鼠模型构建成功。另正常对照组大鼠大肠碳素墨汁推进率、粪便含水率分别为65.42%、68.75%，建模组分别为50.12%、53.04%。

干预期间各组大鼠均无死亡。与正常对照组比较，其余各组大鼠肠道推进率下降（P＜0.05）；与模型对照组和假电针组比较，2 Hz 电针组、50 Hz 电针组肠道推进率均升高（P＜0.05）；与2 Hz 电针组比较，50 Hz 电针组肠道推进率升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠干预后肠道推进率比较（%，）

表1 各组大鼠干预后肠道推进率比较（%，）

注：2 Hz 电针组予以电子针疗仪频率2 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”，50 Hz 电针组予以电子针疗仪频率50 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”，假电针组针刺“后三里”但不通电，模型对照组和正常对照组仅固定处理，与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与假电针组比较，cP＜0.05；与2 Hz 电针组比较，dP＜0.05

3.2 各组大鼠结肠组织病理变化 正常对照组大鼠结肠组织可见完整的黏膜，且肠壁黏膜层、黏膜下层、肌层与外膜层均结构清晰、层次明确，柱状细胞与腺体排列整齐；模型对照组和假电针组黏膜层间质有严重充血、扩张表现，各层次结构不清，有严重上皮损伤（肌层显著变薄、绒毛显著减少）；2 Hz 电针组黏膜层间质有充血、扩张表现，各层次结构轻微紊乱，可见上皮损伤（肌层变薄、绒毛减少）；50 Hz 电针组黏膜层间质基本正常，各层次结构基本清晰，上皮轻微损伤（肌层稍薄、绒毛稍少）。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理变化（HE 染色，×200，刻度尺：50 μm）

3.3 各组大鼠ICC 形态变化 正常对照组大鼠ICC呈星形，主要分布于环形肌深部肌间神经丛，有3～5个突触，不同ICC 间通过突触连接形成网络，且结构完整，长突触与平滑肌紧密连接、网络清晰；模型对照组和假电针组大鼠ICC 突触显著减少，连接松散，网络样结构遭到显著损坏；2 Hz 电针组ICC 突触减少、连接不紧密，网络样结构遭到损坏；50 Hz 电针组ICC 突触数量、连接基本正常，网络样结构基本完整（见图2）。与正常对照组大鼠比较，其余四组ICC 数量、免疫荧光IOD 值均下降（P＜0.05）；与模型对照组和假电针组比较，2 Hz 电针组和50 Hz 电针组ICC数量、免疫荧光IOD 值均升高（P＜0.05）；与2 Hz 电针组比较，50 Hz 电针组ICC 数量、免疫荧光IOD 值均升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠ICC 数量、免疫荧光IOD 值比较（）

表2 各组大鼠ICC 数量、免疫荧光IOD 值比较（）

注：2 Hz 电针组予以电子针疗仪频率2 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”；50 Hz 电针组予以电子针疗仪频率50 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”；假电针组针刺“后三里”但不通电；模型对照组和正常对照组仅固定处理；ICC 为结肠Cajal 间质细胞；IOD 为积分光密度；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与假电针组比较，cP＜0.05；与2 Hz 电针组比较，dP＜0.05

图2 各组大鼠ICC 形态变化（免疫荧光共聚焦显微镜，×200，刻度尺：50 μm）

3.4 各组大鼠结肠组织C-Kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表达比较 与正常对照组比较，其余四组C-kit、p62 蛋白表达均下降（P＜0.05），PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表达均升高（P ＜0.05）；与模型对照组和假电针组比较，2 Hz 电针组和50 Hz 电针组C-kit、p62 蛋白表达均升高（P＜0.05），PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表达均下降（P＜0.05）；与2 Hz 电针组比较，50 Hz 电针组C-kit、p62 蛋白表达均升高（P＜0.05），PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表达均下降（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠结肠组织C-Kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠结肠组织C-Kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3 蛋白表达比较（）

注：2 Hz 电针组予以电子针疗仪频率2 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”；50 Hz 电针组予以电子针疗仪频率50 Hz、强度10 mA 刺激“后三里”，假电针组针刺“后三里”但不通电；模型对照组和正常对照组仅固定处理；C-Kit 为原癌基因；PINK1 为线粒体自噬相关蛋白；Parkin 为帕金蛋白；Beclin1 为自噬效应蛋白1；p62 为核孔糖蛋白；LC3 为自噬相关蛋白3；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与假电针组比较，cP＜0.05；与2Hz 电针组比较，dP＜0.05

4 讨论

STC 发病原因复杂，主要表现为大肠功能紊乱、传导异常，可能与肠神经系统紊乱、ICC 自噬增多、激素水平异常、中枢及自主神经系统调节功能障碍等有关。有研究显示，STC 结肠ICC 细胞突触减少，网络样结构遭损坏，自噬小体增多，细胞自噬严重可导致平滑肌收缩、运动失常，进而引起结肠传导功能障碍[7]。因此减少STC 结肠ICC 自噬是治疗STC 的重要方向。

本研究利用洛哌丁胺混悬液灌胃法制备STC 模型大鼠，建模组首粒黑便排出时间较正常对照组显著延长，证实建模成功，且大肠碳素墨汁推进率、粪便含水率均低于正常对照组，为后续实验提供了条件。本研究还发现，2 Hz 电针组和50 Hz 电针组肠道推进率均低于正常对照组，但均高于模型对照组和假电针组，且50 Hz 电针组肠道推进率高于2 Hz 电针组，表明对STC 模型大鼠予以电针“后三里”有确切效果，且50 Hz 电针效果更佳。电针疗法是针刺法的改良，能够代替手工操作并客观控制刺激量，还可利用电刺激疏经通络、温通气血、祛邪扶正[8]。电针“后三里”穴位可调节五脏六腑功能，促进肠道蠕动，在STC 治疗中有应用价值。而本研究中假电针组肠道推进率与模型对照组相当，说明仅针刺“后三里”对STC 大鼠模型无效，与唐欧风等[9]报道的结论不一致，可能是因为本研究中仅将针刺入“后三里”穴位，但未实施手法治疗，其未通电刺激，而在上述报道中将针刺入穴位后有得气、捻针、留针等操作。本研究还发现，2 Hz 电针组和50 Hz 电针组结肠病理、ICC形态均较模型对照组、假电针组显著减轻，且50 Hz电针组接近正常对照组，与上述分析相符。

STC 结肠ICC 的过度自噬可导致线粒体功能障碍[10]。在此过程中，结肠组织C-Kit 表达下降，而PINK1 转移受阻，PINK1/Parkin 通路被激活，可使得ICC 分化不足或不成熟造成损伤，减低线粒体膜电位，同时还可促进自噬体形成并与溶酶体相融合，产生自噬体溶酶体，启动线粒体自噬，而线粒体大量自噬可导致肠运动及传输功能障碍，最终引发STC[11]。对结肠ICC 阻断PINK1/Parkin 信号通路传导可减少自噬，维持正常的细胞形态与功能，并使得其网络样结构保持完整，且平滑肌的结构和功能也可维持正常，是STC 治疗的新方向[12]。本研究中2 Hz 电针组与50 Hz 电针组结肠组织C-kit、p62 表达均低于正常对照组但均较模型对照组和假电针组升高，而二者结肠组织PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 表达均高于正常对照组但均较模型对照组和假电针组降低，推测电针“后三里”很可能能够通过上调结肠组织C-kit 表达，抑制PINK1/Parkin 通路从而发挥对STC 大鼠模型的治疗作用的，且50 Hz 电针的效果更佳。

综上所述，电针“后三里”可能能够提高STC 模型大鼠肠道推进率，减轻结肠组织病理和ICC 形态学改变，减少ICC 线粒体自噬，且可上调结肠组织C-kit 表达，抑制PINK1/Parkin 通路，下调PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 表达，抑制p62 表达，其中50 Hz电针的作用显著优于2 Hz 电针。