基于红外光谱法对不同连作茬次地黄土壤光谱特征分析

乔 璐， 刘瑞娜， 张 瑞， 赵博宇， 韩盼盼，2， 周春亚，3， 张雨晴，4， 董诚明*

1. 河南中医药大学药学院， 河南 郑州 450046 2. 广州中医药大学药学院， 广东 广州 510006 3. 江西中医药大学药学院， 江西 南昌 330004 4. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所， 北京 100193

引 言

地黄(RehmanniaglutinosaLiBosch.)是玄参科植物， 以新鲜或干燥块茎入药[1]。 主产于河南焦作的怀地黄， 在种植过程中存在着严重的连作障碍， 每茬地黄收获后须隔8～10年后方可再种植[2]。 早在《本草乘雅半偈》就有记载[3]。 具体表现为病虫害加剧， 块根不能正常膨大， 多须根， 产量和品质下降， 严重影响了地黄药用价值， 并制约了道地产区的经济发展。

目前研究认为， 地黄连作障碍主要由3种原因造成： 一是土壤肥力下降[4-7]； 二是地黄连作后， 根际土壤中微生物变化， 大量病原菌迅速滋生， 导致病虫害加剧， 地黄产量下降[8-12]； 三是植物根系的化感自毒作用。 植物连作时， 根系会向土壤中分泌一些次生代谢物质， 这些物质的成分到底是什么， 目前尚无通论。 有学者认为这些次生代谢物质可能是酚酸类成分或者鞣质[11]。 国内外研究地黄连作障碍的手段多聚焦于高效液相色谱法， 微生物培养法以及分子水平研究DNA[3-12]， 但前期样品需求量大、 处理繁琐、 分析时间长， 成本较高。 红外光谱法可以通过分析吸收峰的吸收强度、 位置和形状， 确定官能团， 直观地反映出地黄土壤的差异信息。 本研究采用傅里叶红外衰减全反射(FTIR-ATR)在4 000～400 cm-1波段对正茬1年(YA-one)、 重茬1年(YA-two)、 10年前种植过(YA-ten)、 未种植过地黄的土壤(CK)进行扫描， 提取特征光谱之间的差异性， 建立二维红外相关光谱， 确定官能团， 分析土壤中化合物的指纹图谱。 为地黄连作障碍研究提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料

土壤样品为2019年4月26日采集于河南省焦作市武陟县地黄种植基地(GPS坐标113°16′40″， 34°59′55″)2009年—2019年间分别种植地黄的土壤， 土壤质地是砂质壤土， 土壤类型为垆土， 属石灰性褐土亚类火褐泥砂土土属。 气候条件： 暖温带大陆性季风气候， 年日照时数2 484 h， 无霜期220 d， 年积温4 714.9(≥10 ℃)， 湿度45%， 年平均温度18 ℃， 年平均降水量544.96 mm。 去除土壤表面植物、 腐殖质及表面干燥的土壤， 用灭菌铲挖取5～20 cm深的土样， 采用“S”形五点取样法混合， 在4个样地取样， 采集信息见表1。

表1 地黄土壤采集信息Table 1 Soil collection information of Rehmannia glutinosa

1.2 仪器及试剂

INVENIOS型傅里叶变换红外光谱仪(美国BRUKER公司)， 配有DTGS检测器， 衰减全反射(ATR)附件， pH计(上海雷磁pHS-3E)。

1.3 地黄土壤红外光谱数据采集

取表1中4份地黄土壤样品各适量， 风干粉碎， 过筛。 采用傅里叶红外衰减全反射(FTIR-ATR)， 仪器分辨率为4 cm-1， 样品扫描时间32 s， 背景扫描时间32 s， 扫描范围4 000～400 cm-1。 将取适量收集到的土壤样品放入ATR附件的红外透光晶体表面， 以空气为参比， 扣除H2O和CO2干涉背景后采集光谱图， 按上述试验条件进行扫描， 每个样品重复扫描3次， 求平均光谱。

1.4 数据处理

OMNIC9.2对不同间隔年限种植地黄土壤的光谱进行Norris滤噪平滑， 求二阶导数， 然后利用Origin2019b作图。

2 结果与讨论

2.1 不同间隔年限种植地黄土壤的光谱

图1 不同间隔年限种植地黄土壤的光谱Fig.1 Soil spectra of Rehmannia glutinosaplanted in different interval years

2.4 不同间隔年限种植地黄土壤的二阶图谱

为了提高光谱分辨率， 区分重叠的特征峰， 增大信息量[15]。 对土壤样品红外光谱进行Norris平滑滤噪+二阶导数处理(图2和图3)。

图2 不同间隔年限地黄种植土壤的二阶光谱(4 000～1 200 cm-1)Fig.2 Second-order spectra of Rehmannia glutinosa planting soils with different interval years (4 000～1 200 cm-1)

二阶导数光谱的极小值点(波谷)对应原始光谱的吸收峰位置， 从图4中可以明显看到在4 000～1 200 cm-1波段中的差异性。 其中， 3 750 cm-1在CK、 YA-one、 YA-ten中都有明显吸收峰， 但在样品编号YA-two中。 在3 652 cm-1附近， CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten曲线都出现了吸收峰， YA-two的吸收峰强度最大。 在2 925和2 857 cm-1吸收位置处是糖苷类中饱和亚甲基—CH2的伸缩振动， CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten在此位置处都有吸收， 但不同的是YA-two的吸收强度最小， YA-ten的吸收强度最大。 说明重茬土壤中， 糖苷类成分下降。 1 743 cm-1吸收区CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten都出现了吸收峰， 而YA-two的吸收强度最小。

在1 548 cm-1出现芳环和芳杂环的特征吸收峰， CK、 YA-one、 YA-ten有两小吸收峰， 不太明显， 但YA-two在此波段的两个小吸收峰合并成一个。 1 488 cm-1处CK、 YA-one、 YA-ten都出现了吸收峰， 但YA-two的吸收峰不明显几近消失。

2.5 不同间隔种植年限的地黄土壤的二维相关谱

二维相关红外光谱(2D-IR)是利用不同的外界微扰(如温度)， 在第二维度上展开FTIR 光谱。 二维光谱可以提高光谱的分辨率， 将重叠峰甚至是被掩盖的一些小峰清晰地显示出来， 可用于研究各组分基团分子振动行为的差异， 简化复杂光谱的重叠峰， 揭示各官能团的相互作用[16]。 原谱图在指纹区重叠峰较多， 为了更明显地提高分辨率， 得到更为细致的光谱图， 以未种植地黄的土壤(CK)为标准， 对样品YA-one、 YA-two、 YA-ten在920～1 750 cm-1波段进行二维红外相关光谱处理， 又进一步选取特征波段1 490～1 710和1 500～1 548 cm-1得到图4， 图5和图6。

图4 YA-one的二维红外相关光谱(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1Fig.4 2D-IR of YA-one(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1

图4是YA-one的二维红外相关光谱， 在(a)波段920～1 750 cm-1， 有5个自动峰[18]1 033， 1 634， 1 655， 1 679和1 682 cm-1； 1 033和1 655 cm-1这两个自动峰强度最大； 有三组交叉峰， 按照强弱顺序依次为(1 655， 1 033)， (1 550， 1 033)和(1 655， 1 550) cm-1。 在(b)波段1 490～1 710 cm-1， 有1 508， 1 542， 1 550， 1 628， 1 634， 1 655， 1 679和1 682 cm-18个自动峰， 其中1 634和1 655 cm-1这两个自动峰最为明显； 在此波段的交叉峰按照强弱顺序依次为(1 655， 1 634)， (1 682， 1 655)， (1 682， 1 634)， (1 655， 1 550)和(1 655， 1 542) cm-1。 在(c)波段1 500～1 548 cm-1中， 有1 506和1 542 cm-1这2个自动峰； 还有(1 542， 1 524)和(1 518， 1 506) cm-1这2组交叉峰。

图5是YA-two的二维红外相关光谱， 在(a)波段920～1 750 cm-1， 有两个自动峰， 分别为1 033和1 634 cm-1， 1 033 cm-1的自动峰比1 634 cm-1强； 但在此波段没有交叉峰。 在(b)波段1 490～1 710 cm-1， 有1 542， 1 603和1 634 cm-1三个自动峰， 1 603和1 634 cm-1这两个自动峰相对较强； 还有两组交叉峰， 按照强弱顺序依次是(1 634， 1 603)和(1 628， 1 542) cm-1。 在(c)波段1 500～1 548 cm-1中， 出现一个很强的自动峰， 为1 542 cm-1， 一组交叉峰， 为(1 542， 1 524) cm-1。

图5 YA-two的二维红外相关光谱(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1Fig.5 2D-IR of YA-two(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1

图6是YA-ten的二维红外相关光谱， 从图中可以看到， 在(a)波段920～1 750 cm-1， 有4个自动峰， 分别为1 033， 1 628， 1 634和1 655 cm-1， 其中1 033和1 634 cm-1这2个自动峰更为明显； 在此波段中还有5组交叉峰， 按照强弱顺序依次为(1 655， 1 628)， (1 634， 1 033)， (1 655， 1 033)， (1 634， 1 550)， (1 679， 1 634)和(1 550， 1 033) cm-1。 在(b)波段1 490～1 710 cm-1中， 有5个自动峰， 分别为1 550， 1 628， 1 634， 1 655和1 682 cm-1， 其中1 628， 1 634和1 655 cm-1这3种自动峰较为明显； 在此波段中， 还有3组交叉峰， 按照交叉峰的强弱顺序依次为(1 655， 1 628)， (1 682， 1 634)和(1 634， 1 550) cm-1。 在(c)波段1 500～1 548 cm-1中， 有3组自动峰最明显， 分别为1 506， 1 542和1 550 cm-1； 在此波段中， 有6组交叉峰， 按照交叉峰强弱顺序依次为(1 542， 1 506)， (1 518， 1 506)， (1 548， 1 506)， (1 548， 1 542)， (1 530， 1 506)和(1 542， 1 518) cm-1。

图6 YA-ten的二维红外相关光谱(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1Fig.6 2D-IR of YA-ten(a)： 920～1 750 cm-1； (b)： 1 490～1 710 cm-1； (c)： 1 500～1 548 cm-1

综上所述， 不同间隔种植年限的地黄土壤在波段920～1 750， 1 490～1 710和1 500～1 548 cm-1中， 自动峰和交叉峰的位置、 个数、 以及强弱都不相同， 说明二维红外相关光谱可以用来区分不同种植茬次的地黄土壤。

3 结 论