禽白血病净化中胎粪检测方法的研究

陈小娇，张 妹，陈文平

（北京市华都峪口禽业有限责任公司，北京 101206）

禽白血病是指由反转录病毒科中禽反转录病毒属的成员—禽白血病/肉瘤病毒群病毒（ALV/RSV）引起的禽类各种可传播的良性和恶性肿瘤[1]。ALV 感染在生产中引起的损失主要体现在两方面，一方面是产生肿瘤，导致鸡只直接死亡；另一方面是产生非肿瘤综合征，主要表现为生产指标发生变化，如性成熟推迟、母鸡产蛋率下降、蛋重下降、受精率下降和孵化率下降等。ALV 传播方式主要有两种，一种是由母鸡传给子代鸡，即为垂直传播。母鸡感染病毒后，病毒在输卵管的膨大部进行大量复制，随之感染种蛋。大量病毒在感染胚胎的胰腺积聚，并从刚出壳雏鸡的粪便中排出，具有很强的传染性[2]。另一种是感染鸡与健康鸡之间的直接或间接接触而传播，即为水平传播[3]。鸡只之间的水平传播主要发生在孵化期间和出雏后的前2 周内，尤其是雏鸡出壳后48 h 内，具有很强的传播性，因此胎粪检测是禽白血病净化程序的“重中之重”。针对规模化养殖场1 日龄雏鸡数量多、禽白血病净化检测任务重和检测时间紧迫等问题，亟需建立一套快速、有效、准确的胎粪检测方法。本研究对1日龄雏鸡胎粪ALV 检测方法进行优化，建立一套适合规模化养禽场的胎粪ALV 检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）父母代京红1 号的1 日龄雏鸡胎粪样品。（2）主要试剂盒和仪器：ALV p27 抗原ELISA 检测试剂盒购自美国IDEXX 公司；酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；洗板机购自美国伯腾仪器有限公司；电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 按照IDEXX 公司的ALV p27抗原ELISA 检测试剂盒说明书规定的方法检测。

1.2.2 试验分组 （1）未冻融与冻融检测对检测结果的影响。取90 份1 日龄雏鸡胎粪样品，将每一份样品均分为 3 等份，分别对应未冻融、-196 ℃ 液氮冻融、-20 ℃ 冰箱冻融3 个组，研究胎粪样品未冻融与冻融对检测结果的影响及液氮或冰箱冻融对实验结果的影响。（2）不同冻融温度对检测结果的影响。取90 份1 日龄雏鸡胎粪样品，将样品颠倒数次混合均匀后编号，将每一份样品平均分成2 个等份，分别经过液氮冻融和冰箱冻融后进行检测，研究液氮与冰箱冻融后对检测结果的影响。（3）胎粪不加稀释液与加入稀释液对检测结果的影响。取270 份1 日龄雏鸡胎粪样品编号，冷冻后对270 份样品进行检测，将其中1~90 号样品加0.5 ml 稀释液后再检测，1’~90’号样品加0.5 ml 稀释液后再次冷冻，1”~90”号样品不加稀释液再次冷冻，解冻后将1’~90’号和1”~90”样品再次进行检测，研究稀释液量及加入时间对检测结果的影响。（4）多个样品混合对检测结果的影响。取40 份1 日龄雏鸡胎粪样品编号，冻融后进行一次检测，之后将每两份胎粪样品进行混合，充分摇匀混合后取上清再次检测，研究多个样品混匀对检测结果的影响。

2 结果与分析

2.1 未冻融与冻融对检测结果的影响

胎粪样品经冰箱与液氮冻融后均比未冻融的样品阳性率高。结果见表1。

表1 胎粪未冻融与冻融后检测ALV p27 抗原结果

2.2 不同温度冻融样品对检测结果的影响

胎粪样品 -20 ℃ 冰箱冻融与 -196 ℃ 液氮冻融检测的阳性率差异不显著。结果见表2。

表2 不同温度冻融样品对检测结果的影响

2.3 胎粪不加稀释液与加入稀释液对检测结果的影响

在冻融之后加稀释液再进行检测，检测阳性率有所下降，灵敏度降低。在冻融之前不加稀释液和加稀释液对检测结果没有影响。结果见表3。

表3 胎粪不加稀释液与加入稀释液检测ALV p27 抗原结果

2.4 胎粪单样与混样检测对检测结果的影响

胎粪单样与混样检测结果存在差异，多份胎粪混样会影响样品的检出率，会有假阳或假阴性的产生。胎粪单样与混样检测ALV p27 抗原，结果见表4。

表4 胎粪单样与混样检测ALV p27 抗原结果

3 讨论

试验表明，采集胎粪样品时加入0.5 ml 稀释液，对检测结果无明显影响，加入稀释液能够增加样品上清液的量，不仅能够提升加样速度，而且能够避免加样时吸入沉渣，避免堵塞洗板机。稀释后的待检胎粪样品便于上清液的吸取，且杂质含量减少，在检测过程中易于清洗，不会影响后续实验步骤，确保检测结果更准确。胎粪样品冻融有助于胎粪中的P27 蛋白游离出来，提高对P27 的检出率，为缩短冻融时间，减少出壳雏鸡上架之前的存放时间，减少鸡群应激，胎粪样品应采用液氮方式冻融。同时，胎粪阳性样品混合后检测结果变为阴性，会造成漏检情况；同时也会导致阴性样品检测结果变为阳性，存在假阳性的问题，因此胎粪检测需进行单只采集，逐只普测，避免多个雏鸡胎粪样品混合后检测会有假阳性或假阴性的产生，从而影响净化效果。

禽白血病的传播方式主要以垂直传播为主，各代次呈现逐级放大的效应，严重影响雏鸡质量[4]。禽白血病净化是行业健康发展的需求，需要将禽白血病消灭在种源环节，切断垂直传播途径，从而保证种源健康。禽白血病的水平传播主要发生在孵化期间和出雏后的前2 周内，而孵化环节是雏鸡孵育的第一个环节，也是最重要的环节。根据禽白血病的传播特点，1 日龄雏鸡胎粪检测是净化程序的关键，是建立阴性鸡群的第一步，对做好禽白血病净化工作起着至关重要的作用。通过总结多个批次胎粪检测工作，完善雏鸡胎粪检测的每一个环节，选择快速且适合胎粪检测的方法，各个关键点的严格控制保证实验检测数据的准确性，避免家系间的交叉感染等多方面措施来保证雏鸡检测工作顺利运行，有效地控制ALV传播。