外泌体miRNAs——运动促进心血管健康的新靶点

马春莲，柳 华，熊晓玲，杨 翼

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）致死、致残率较高。美国心脏协会（Amer‑ican Heart Association， AHA）统计显示，2015—2018年全球≥20岁的成年人患CVD的几率达49.2%，2019年一年内全球因CVD死亡的人数约87.5万（American Heart Associa‑tion，2022）。《中国心血管健康与疾病报告2020》显示，我国各类CVD患者达3.3亿，因CVD死亡的人数占全国死亡人数的43%以上，CVD依然是我国居民的首要死因（国家心血管病中心，2021）。尽管心血管研究和临床护理的进步提高了CVD患者的生存率，但鉴于持续较高的死亡率，仍需要良好的预防、治疗策略。运动可以为身体多个系统带来益处，降低CVD和2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）35%～55%的发病风险（American Association of Diabetes Educators，2012），已经成为预防及缓解CVD的有效措施之一。

外泌体（exosomes，EXO）是由不同类型细胞分泌的直径在40～150 nm的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），可将其包裹的 microRNAs（miRNAs）、蛋白质、脂质等物质传递到受体细胞（Pluchino et al.，2019），在细胞之间、细胞与组织之间发挥重要的信息传递作用，参与多种生理和病理过程。EXO具有内分泌、旁分泌和自分泌的特性，不同细胞来源及细胞微环境会影响EXO的分泌及功能（Kalluri et al.，2020）。运动作为机体强烈的刺激可调控EXO的分泌及其内含物，体内75%的运动因子存在于EXO中（Safdar et al.，2016）。

miRNAs是一种长度为22～25个核苷酸，通过与mRNA的3’端结合，在转录后调控基因表达的非编码单链RNA（Henning，2021）。miRNAs通过降解mRNA或抑制mRNA的翻译，在生物发育、代谢调节、肿瘤发生发展等方面发挥重要调控作用。单个miRNA可以靶向数百个mRNA，而单个mRNA也可以被多个不同miRNAs靶向（Romao et al.，2014），体现出miRNA强大、复杂和灵活的调控潜力。哺乳动物超过60%的蛋白编码基因直接被miRNAs调控（Friedman et al.，2009）。exomiRs是EXO中重要的内含物，由于受脂质双层的保护，免于RNA酶分解（Shelke et al.，2014），从而能更有效地调控细胞转录后过程。

研究表明，EXO尤其EXO内含的miRNAs（exomiRs）参与了心血管健康的调控。运动促进心血管健康或许是EXO作为细胞间通讯媒介，介导运动产生了多系统效应。基于此，本研究对exomiRs介导运动在促进心血管健康方面的作用进行综述。

1 exomiRs的来源及去路

exomiRs的形成是复杂而精密的调控过程。细胞核内miRNA基因在RNA聚合酶的作用下生成前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA出核后在细胞浆内经过进一步加工，形成成熟的miRNA（Michlewski et al.，2019）。EXO在生成过程中对细胞浆内成熟的miRNAs进行分选及包裹。细胞膜的内陷形成早期内体（early sorting endosome，ESE），ESE的膜内陷选择性地包裹细胞浆内的miRNAs、脂质、蛋白质等物质（Henning，2021），形成含有腔内小泡（intraluminal vesicles，ILVs）的晚期内体（late sorting endosome，LSE），随着ILVs的逐渐积累，LSE形成多泡体（multivesic‑ular bodies，MVBs）。溶酶体调控MVBs的降解及EXO的释放。MVBs生成后可以与溶酶体融合，被降解供细胞循环利用，也可以与细胞膜融合将ILVs释放到细胞外，即为含特定miRNAs的EXO（Kalluri et al.，2020）。EXO被释放后可以通过受体细胞内吞、受体-配体介导的胞吐、与受体细胞膜融合3种形式将exomiRs释放到受体细胞（Wang et al，2019）。进入受体细胞的exomiRs与mRNA靶基因结合（Achkar et al.，2016），从而调控靶基因的降解或抑制其翻译过程（图1）。

图1 exomiRs的来源及去路示意图Figure 1. Schematic Diagram of the Source and Destination of exomiRs

2 运动对EXO分泌及exomiRs表达的调控

2.1 一次性运动对EXO分泌及exomiRs表达的调控

Fruhbeis等（2015）对12名运动爱好者（每周运动超过3 h）进行研究发现，在一次性递增强度自行车运动至力竭（起始负荷50 W，每3 min增加50 W）过程中，运动强度达到个体乳酸阈强度前EXO的分泌就已经开始了。运动后即刻循环EXO的水平显著高于运动前，并在运动结束90 min后恢复到静息水平。男性大学生进行递增强度的自行车运动至力竭（起始负荷60 W，每1 min增加30 W），运动后即刻血浆中血小板和中性粒细胞来源的EVs显著升高，运动后2 h血浆中EVs的水平仍显著高于静息状态（Chaar et al.，2011）。Sossdorf等（2011）对 16名健康男性（根据运动水平分为训练组与久坐组）进行最大摄氧量和个体乳酸阈水平的测试发现，两组受试者分别以80%个体无氧阈强度进行90 min自行车运动后血小板、单核细胞、内皮细胞（endothelial cells，ECs）来源的EVs数量显著增加，但训练组血浆EVs峰值出现在运动后45 min，久坐组则出现在运动后2 h。有研究发现，运动员进行递增强度自行车运动至力竭（起始负荷40 W，每3 min增加40 W），运动后即刻ECs、血小板、各种类型白细胞来源的EVs显著增加（Brahmer et al.， 2019）。以上研究结果显示，一次性运动能促进EXO的分泌，并且不同运动水平的受试者体内EXO产生与清除的代谢动力学不同。一次性运动促进心血管细胞来源EXO的分泌，由于EXO具有母细胞的某些特性，提示，运动诱导的心血管细胞来源EXO水平的变化可能与运动改善心血管功能、免疫调节、炎症有关。

exomiRs是EXO参与机体生理和病理过程调控的重要内含物。近年研究发现，运动参与了exomiRs生成过程的调控，并促进了特定exomiRs的表达。Whitham等（2018）研究发现，1 h自行车运动（30 min 55%O2max强度，20 min 70%O2max强度 ，10 min 80%O2max强度）可以促进包括EXO和ILVs结构蛋白在内的超过300种蛋白质表达增加，并且促进EVs向肝脏转移蛋白质。一次性有氧＋抗阻运动（双腿以55%O2max强度进行45 min自行车运动＋3组55% 1RM强度的单腿8～12次的伸膝运动，组间间歇2 min）上调了健康男性股外侧肌MVBs合成相关蛋白Clathrin和Alix的mRNA表达，同时促进了miRNA加工相关蛋白Dicer和Exportin 5的mRNA表达，并且运动诱导的MVBs合成相关蛋白基因表达量与miRNA加工相关蛋白基因表达量呈正相关（Garner et al.，2020）。提示，一次性运动促进了与EXO生成相关蛋白质的合成。

虽然，还没有直接证据证明一次性运动促进miRNAs分选并包裹进EXO，至少说明在运动中EXO和miRNAs的生物合成途径遵循着类似的时间轴，提示一次性运动可能促进miRNAs分选并包裹进EXO的动态过程。Lovett等（2018）发现，倍增跳跃联合下山跑的训练（10组10次90%最大跳跃高度，组间间隔1 min，跳跃完成5 min后以10 km/h的速度进行5组4 min的下山跑，坡度为10%，组间间隔2 min），可以选择性地改变健康男性循环EVs中的miR‑NAs，而这些EVs中表达改变的miRNAs参与了骨骼肌损伤后的内源性修复。D’Souza等（2018）发现，一次性高强度间歇运动（10组60 s最大输出功率的自行车运动，组间间歇75 s）使血浆EXO内含miR-126-3p、miR-23a-3p、miR-208a-3p等9种exomiRs表达显著上调，并且发生变化的exomiRs与运动诱导的骨骼肌及血浆中发生变化的miR‑NAs并不完全一致，提示，运动调控了EXO生成过程中miRNAs的分选，选择性地促进特定exomiRs的表达。

2.2 长期运动对EXO分泌及exomiRs表达的调控

长期规律性运动可以提高人体免疫力，缓解代谢综合征，提高生活质量（孙海波 等，2020）。长期运动是否能影响EXO分泌及exomiRs表达备受学者关注。Bertoldi等（2018）研究发现，相比于3月龄大鼠，21月龄及26月龄老年大鼠EXO特异性标志蛋白CD63的表达显著降低，2周中等强度的跑台运动（60%O2max，每天20 min）显著上调了老年大鼠循环EXO中CD63的蛋白表达，下调了循环EXO内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。Wang等（2020）研究发现，4周中等强度的跑台运动（10 m/min）可增强小鼠循环内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）来源EXO的分泌，上调EPCs来源exomiR-126的表达水平，减少中动脉阻塞诱导的细胞损伤。前期研究发现，db/db糖尿病小鼠进行4周跑台运动（低强度5 m/min，中等强度10 m/min，每天60 min，每周5天）可强度依赖性地促进EPCs来源EXO的分泌，上调exomiR-126的表达水平（Ma et al.，2018）。此外，8周中等强度的有氧运动（7 m/min，每天300 m，每周5天）促进了db/db糖尿病小鼠心源性EXO中exomiR-455、exomiR-29b、exomiR-323-5p和exomiR-466的表达（Chaturvedi et al.，2015）。

相比于久坐者，周期性运动的老年人基础状态下血清exomiR-486-5p、exomiR-215-5p、exomiR-941的水平显著上调，两组受试者一次性运动后血清exomiRs的表达谱也不相同，周期性运动者血清中产生变化的exomiRs主要与代谢激活的信号转导有关（Nair et al.，2020），提示，长期运动通过调控循环exomiRs的表达谱调节老年人的代谢能力。Hou等（2019）对经过1年以上团体赛艇训练（每天1～2 h，每周6天）的运动员和未训练者进行研究发现，在最后一次运动24 h后血浆EXO大小、浓度未见显著差异。值得注意的是，长期运动者血浆EXO对心肌细胞有保护作用，而未训练者EXO则无此效应，EXO对心肌细胞的保护作用通过 exomiR-342-5p实现（Hou et al.，2019）。以上研究提示，长期规律性运动或许并不能改变基础状态下循环EXO的大小及浓度，但可以选择性地促进体内某些特定细胞来源EXO的分泌。更重要的是，长期运动能调控exomiRs的表达谱，运动通过调控特定exomiRs的表达变化发挥健康促进的有益效应。

3 exomiRs介导运动促进心血管健康

3.1 exomiRs介导运动促进心脏健康

研究发现，exomiRs参与了心血管健康的调控。Ruan等（2018）研究发现，速效救心丸（心绞痛和冠心病的常用药物）可以促进小鼠心肌间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源EXO的分泌，抵抗缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）产生的心肌损伤。心肌祖细胞（cardiac progenitor cells，CPCs）来源的exomiR-133a可以降低心肌肥厚，抑制细胞凋亡，促进心脏收缩功能（Izarra et al.，2014）。CPCs来源的exomiR-451可以保护心肌细胞缓解氧化应激性损伤（Chen et al.，2013）。干细胞移植能促进坏死心脏区域心肌及血管再生，是心血管疾病治疗中非常有应用前景的治疗手段。造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）由骨髓向外周的运转活力是影响移植效果的重要因素。富含miR-126的EVs能抑制骨髓HSCs血管细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule1，VCAM1）的表达，促进HSCs向外周血的运转（Salvucci et al.，2012）。Shao等（2017）研究发现，在心肌梗死（miocardial infarc‑tion，MI）的治疗中，胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）来源的EXO能抑制心肌纤维化、炎症，改善心脏功能，治疗MI比ESCs移植更有效，该研究发现，ESCs来源的exomiR-15、exomiR-21显著富集是产生良好治疗效果的原因。小鼠I/R前5 min注射MSCs来源EXO可增强心肌细胞活力，减少45%的梗死面积，保护心室的结构及收缩功能（Arslan et al.，2013），提示，EXO作为MI治疗剂具有巨大潜力。MI发生后21天心脏疤痕组织已经形成，此时向心肌注射心肌球样细胞（cardiosphere-derived cells，CDCs）来源EXO，可增加心肌细胞的存活、减少心脏的疤痕、改善心室射血功能，CDCs来源的exomiR-146a的抗氧化应激效应在缓解MI损伤，保护心脏功能中发挥了关键作用（Ibrahim et al.，2014）。以上研究证实，多种细胞来源的EXO通过特定exomiRs的调控缓解了病理状态下心肌细胞的损伤，改善了心脏功能。

体育运动可以减少心肌梗死面积，促进CVD患者的心肺功能（石晓明 等，2017；Hou et al.，2019）。有研究证实，exomiRs参与了运动对心脏功能的调控。Brahmer等（2019）研究发现，中等强度的有氧运动引起血小板、白细胞、ECs等细胞来源EVs的释放。急性MI发生后，运动康复诱导心脏分泌富含抗纤维化作用的exomiR-29b、exomiR-323-5p、exomiR-455、exomiR-466，上述exomiRs可以下调基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9），从而降低MI后的不良重塑（Chaturvedi et al.，2015）。Hou等（2019）建立大鼠MI模型并将长期运动者血浆EXO进行大鼠心外注射，发现运动诱导的血浆exomiR-342-5p可以靶向抑制caspase 9和c-Jun氨基末端激酶2（c-Jun N-terminal kinase enzyme，JNK2）基因的表达，降低心肌梗死面积，提高心室射血分数，对心肌产生保护效应。细胞实验发现，长期运动者血浆EXO能抑制细胞凋亡，降低乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的分泌，增加细胞活力，缓解心肌细胞因缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）刺激而产生的损伤（Hou et al.，2019）。缺氧预处理可模拟机体运动中缺氧的特性，研究发现，缺氧预处理可以促进CPCs来源EXO的分泌，并使CPCs来源的exomiR-103、exomiR-15b、exomiR-292等7种exomiRs表达上调，参与ECs血管生成以及心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）分化相关的调控，将CPCs来源EXO通过心肌注射应用于I/R大鼠，可促进血管生成，减少心肌纤维化，改善心脏射血功能（Gray et al.，2015）。综上，运动可以选择性地促进特定细胞来源exomiRs的表达，运动以及模拟运动特性的刺激所诱导的exomiRs表达变化在促进心血管健康中发挥了关键作用（表1）。

表1 运动及模拟运动特性的实验中exomiRs促进心血管健康的主要研究Table 1 The Main Research on the Promotion of Cardiovascular Health by exomiRs in the Experiments of Exercise and Simulated Exercise

3.2 exomiRs介导运动促进血管健康

伴随老龄化的发展，高血压、动脉粥样硬化（athero‑sclerosis，AS）等血管疾病高发。有研究发现，EXO以及exomiRs参与了血压及血管钙化的调节。Otani等（2018）将自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats， SHR）血浆EXO腹腔注射入正常大鼠体内能引起收缩压升高、胸主动脉壁增厚、胶原减少和心室肌纤维化，相反将正常大鼠血浆EXO注射进SHR大鼠体内，能使收缩压降低，心室肌纤维化得到缓解。骨髓MSCs来源EXO的运用可以降低高磷共孵育平滑肌细胞（smooth muscle cells， SMCs）的钙含量和碱性磷酸酶活性，抑制SMCs的钙化（Guo et al.，2019）。骨髓 MSCs来源 exomiR-146a可以靶向抑制SMCs硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的活性，降低ROS的产生及SMCs的成骨样分化，缓解糖基化终产物对血管SMCs的损伤（Wang et al.，2018）。MSCs来源EXO与CDCs共培养改变了CDCs中miRNAs的表达谱，在MI后促进CDCs的存活，降低心肌纤维化，增加毛细血管密度（Zhang et al.，2016）。当将人体CD34＋干细胞EXO注入小鼠缺血后肢（hind-limb ischemia，HL/I）时，可通过exomiR-126-3p抑制ECs出芽相关蛋白1（sprouty-related protein-1，SPRED1）的表达，改善缺血后肢毛细血管密度，促进后肢运动能力（Mathiyalagan et al.，2017）。Van Balkom等（2013）研究发现，ECs通过exomiR-214以自分泌的方式促进ECs的迁移、血管生成，改善毛细血管扩张失调。

运动可以促进血管的顺应性，缓解动脉硬化，逆转SMCs的不良表型转化，提高其收缩功能（陈金鳌 等，2014；廖静雯 等，2018；王帝之 等，2019）。有证据表明，exomiRs参与了运动对心血管调控的有益效应。少年男子自行车运动员急性运动中和运动后，调控血管功能的miR-126显著增加（Kilian et al.，2016），而miR-126主要来自ECs并大量存在于循环EVs中（Jansen et al.，2014）。4周中等强度的跑台运动（10 m/min，每天60 min，每周5天）可以上调EPCs来源exomiR-126水平，缓解高糖诱导的ECs凋亡，促进ECs的迁移及成管能力（Ma et al.，2018）。运动可以造成体内缺血、缺氧，能量需求及血流剪切应力增加等急性应激反应。用能量剥夺的体外实验模拟在体运动状态的研究发现，能量剥夺促进ECs分泌EVs，并将其富含的miR-126、miR-21转运到 SMCs（Wahl et al.，2016），提示，在运动状态下，EVs充当了ECs和SMCs之间信息交流及物质转运的媒介，调控运动对血管的有益效应。另一项研究发现，能量剥夺促进心肌细胞释放富含葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）、LDH和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase，GAPDH）的EXO，这些EXO被邻近的ECs摄取，参与ECs的能量代谢调节（Garcia et al.，2016）。剪切应力增加是运动中血流产生的重要变化。体外研究发现，剪切应力刺激促进久坐者血小板来源EVs的释放（Chen et al.，2010）。以剪切应力刺激人血管ECs可以促进EXO的分泌并上调exomiR-143、exomiR-145的表达，将EXO与SMCs共培养诱导了SMCs基因表达变化及表型转化，缓解了载脂蛋白E（apolipopro‑tein E， ApoE）基因敲除小鼠动脉粥样硬化的形成（Hergen‑reider et al.，2012）。心肌缺血时供血供氧能力受损，而血管生成对于促进缺血心脏的再灌注和功能恢复至关重要。缺氧预处理可以促进CDCs来源EXO中exomiR-210、exomiR-130a和exomiR-126的表达上调，用CDCs来源EXO与血管ECs共培养后，可促进ECs的血管生成（Namazi et al.，2018）。以上在体及离体研究提示，多种细胞来源的EXO通过exomiRs在心血管细胞功能调控中发挥了关键作用（图2）。exomiRs介导运动促进了体内多个系统的信息交流及物质转运，在病理状态下发挥对心血管系统的保护效应。

图2 不同细胞来源exomiRs对心血管细胞的调控Figure 2. Regulation of Cardiovascular Cells by exomiRs from Different Cells

4 exomiRs在CVD中的未来应用展望

4.1 exomiRs作为CVD预测和诊断的生物标志

exomiRs表达谱受身体健康状况影响，特定疾病会诱导体内产生特异性exomiRs（Garcia-Contreras et al.，2017）。在心肌病的诊断中，患者循环exomiR-133a在肌酸激酶、肌钙蛋白等传统生物标志物升高之前就发生了显著升高（Kuwabara et al.，2011），提示，特定exomiRs在预测心肌病发病中具有很高的敏感性。在所有MI患者中，大约25%会在1年内发生心力衰竭而面临死亡（Velagaleti et al.，2008）。Matsumoto等（2013）研究发现，急性MI后2～3周患者血清exomiR-194和exomiR-34a显著增加，而这些exomiRs的水平增加更易于使患者在后期发展成心力衰竭。稳定型冠心病患者循环exomiR-199a、exomiR-126的水平与心血管不良事件发生风险呈负相关，而循环miR-199a和miR-126与心血管不良事件发生风险并无相关性（Jansen et al.，2014）。加之被脂质膜包裹免受RNA酶的降解（Cheng et al.，2014），循环exomiRs相比循环miRNAs能更加敏感而稳定地预测心血管健康状态。此外，长期运动能上调循环exomiR-342-5p以及心源性exomiR-29b、exomiR-323-5p、exomiR-455、exomiR-466的表达，产生心血管保护效应（Chaturvedi et al.，2015；Hou et al.，2019），提示，在心肌梗死患者的运动康复中，可以通过测试上述exomiRs的表达判断疾病进展及运动康复效果。相比临床指标，exomiRs在CVD的诊断、病理发展、不良心血管事件发生风险预测中具有较高的敏感性，有望发展为CVD风险预测、临床诊断以及运动康复效果评定的生物标志物。

4.2 exomiRs成为CVD靶向治疗的新方法

运动通过调控EXO的代谢动力和exomiRs表达谱对心血管产生保护作用。干细胞来源的EXO具有母细胞的某些特性，可以降低心肌纤维化和不良重塑，促进血管增生，提高心血管功能，在CVD的治疗中比母细胞产生更好的效果（Davidson et al.，2018）。加之EXO的纯化、输送和储存比干细胞制备和输送更加简单和快捷。所以，收集健康年轻人或长期运动者的血液并制备EXO，将其注入CVD患者体内，有望成为治疗CVD的新方法。EXO是转运核酸的天然载体，相比现有的核酸载体具有更加优越的循环稳定性、生物相容性和较低的毒性（Lin et al.，2020）。随着对EXO生物生成、包装机制、生理特性的了解，未来通过基因技术将某些特定miRNAs装载到EXO制备纳米药物，利用EXO归巢能力强、靶外效应小的特点（Floriano et al.，2020；Tomasetti et al.，2017）实施无细胞靶向治疗CVD，将成为可能。

5 结语

EXO分泌是体内存在的基本生理过程，分泌缺乏将诱发病理过程（Alexander et al.，2017）。运动促进了特定EXO的分泌，调控了exomiRs的表达谱，exomiRs介导运动在促进心血管健康方面发挥了重要作用，在临床CVD的预防、诊断及治疗中具有很好的应用前景。但是，目前的研究与临床应用还有一定距离，某些问题尚待进一步阐释：1）EXO的粒径范围与EVs中微囊泡的粒径范围出现重叠（Lawson et al.，2016），不同研究中EXO粒径的界定也有分歧（Lawson et al.，2016；Pluchino et al.，2019），需在未来研究中规范EXO的粒径范围，确保研究结果的准确性。2）鲜见exomiRs介导运动调控心血管健康的研究，尤其是在体研究。后期尚需加大研究力度，期望临床实现运动处方科学指导运动来调控exomiRs的表达，从而达到内源性非药物治疗CVD的目的。3）不同细胞来源EXO的半衰期不同（Saunderson et al.，2014；Takahashi et al.，2013），不同注射途径也会影响EXO在体内的分布（Zhou et al.，2020）。因此，后期在EXO的代谢动力学方面还需深入研究，以便能在临床应用中寻找治疗CVD的最佳注射时间和注射途径。