基于网络药理学分析黄芪-附子治疗慢性心力衰竭的作用机制

李俊辉，李悦，朱灵妍，姚成增

1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.上海市徐汇区中心医院，上海 200031

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多种原因引起心脏功能或结构异常，使心脏泵血量减少，不能满足组织器官代谢需求的临床综合征[1]。CHF是大多数心血管疾病的终末阶段，患病率和致死率逐年升高，给社会带来极大负担[2]。西医常用利尿剂、强心剂和β受体阻滞剂等改善CHF症状，但长期服药会出现不同程度的不良反应，整体疗效及安全性仍有待提高。中医药治疗CHF疗效确切、不良反应少，可明显改善患者症状，提高生活质量。中医认为，CHF病机为本虚标实，治疗应以温补阳气为主，兼活血、利水、行气[3]，临床多用黄芪-附子等温补阳气药对为代表的方剂，疗效满意。但目前鲜有关于黄芪-附子治疗CHF机制的论述，本研究基于网络药理学方法分析黄芪-附子治疗CHF的潜在作用机制，以期为临床治疗CHF提供依据。

1 资料与方法

1.1 黄芪-附子活性成分筛选及靶点获取

在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[4]数据库以“huangqi”“fuzi”为关键词进行检索，获取黄芪-附子活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件进一步筛选有效成分。通过TCMSP 数据库查询有效成分对应靶点，并导入UniProt（https://sparql.uniprot.org/）数据库对靶点名称进行标准化处理。

1.2 疾病靶点及交集靶点获取

在PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）[5]、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）[6]、OMIM（https://omim.org/）数据库以“chronic heart failure”为关键词检索CHF相关靶点，将疾病靶点与药物靶点取交集，交集靶点即黄芪-附子治疗CHF的潜在靶点。

1.3 蛋白相互作用网络构建

将交集靶点导入STRING（https://www.string-db.org/）[7]平台，绘制蛋白相互作用（PPI）网络，将PPI网络导入Cytoscape3.7.2软件进一步简化筛选，获取核心靶点网络。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R语言3.6.3软件相关数据包对交集靶点进行GO功能和KEGG富集分析，筛选qvalue＜0.05的分析结果进行展示。

2 结果

2.1 药物活性成分与靶点

在TCMSP获取黄芪活性成分20个，附子活性成分21个，无共有成分。进一步获取活性成分对应的靶点，有19个活性成分无对应靶点，剩余22个活性成分（见表1）对应靶点492个，去除重复后得到靶点191个。将靶点导入UniProt数据库转化为UniProt ID，通过Cytoscape3.7.2 软件构建药物-活性成分-靶点网络（见图1），节点越大度值越大，节点间连线表示相互作用关系，活性成分平均度值为20.63，按度值由大到小排序，前10位活性成分见表2。

表2 黄芪-附子活性成分（度值前10位）

图1 黄芪-附子治疗CHF药物-活性成分-靶点网络

表1 黄芪-附子主要活性成分

2.2 疾病靶点及交集靶点

在PharmGKB、TTD、GeneCards、OMIM数据库分别得到CHF靶点16、13、10 531、153个，经去重后，共得到CHF相关靶点10 573个。利用Excel2016将疾病靶点和药物靶点取交集，得到交集靶点183个，Venn图见图2。

图2 黄芪-附子治疗CHF靶点Venn图

2.3 蛋白相互作用网络

将183个交集靶点导入STRING数据库，建立黄芪-附子治疗CHF 靶点PPI 网络，见图3。利用Cytoscape3.7.2软件对网络进行拓扑分析，筛选中介中心性（between centrality）≥19.565、紧密中心性（closeness centrality） ≥0.561、度中心性（degree centrality）≥10.5、特征向量中心性（eigenvector centrality）≥0.136、位置中心性（location centrality）≥4.558、邻域连通性（neighborhood connectivity）≥5.910的靶点，最终得到由14个核心靶点、108条边组成的核心靶点PPI网络，见图4。

图3 黄芪-附子治疗CHF靶点PPI网络

图4 黄芪-附子治疗CHF核心靶点PPI网络

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析结果

对交集靶点进行GO分析，得到2 625个条目，包括生物过程（BP）2 324 个、细胞组分（CC）88 个，分子功能（MF）213个，结果按qvalue从小到大排序，BP、CC、MF前10个条目见图5。BP主要涉及细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、对药物的反应（response to drug）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）等；CC 主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、膜区（membrane region）等；MF主要涉及DNA/RNA转录因子活性、蛋白受体活性。KEGG通路富集分析筛选前30 条通路，主要包括AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路等，见图6。

图5 黄芪-附子治疗CHF靶点GO富集分析

图6 黄芪-附子治疗CHF靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

现代医学认为，血脂、血糖、血压异常及吸烟、饮酒、饮食失节等不良生活习惯会影响或加快CHF进程，主要从增加心肌收缩力、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活等角度治疗。古代文献有与CHF临床表现相似的描述，如《素问·举痛论篇》“劳则喘息汗出，外内皆越，故气耗矣”，《金匮要略》“心水者，其身重而少气，不得卧，烦而躁，其人阴肿”，《灵枢·胀论》“夫心胀者，烦心短气，卧不安”。CHF可属中医学“心水”“心胀”等范畴，病机为本虚标实，临床以气虚证为主。气虚无力推动血行而成瘀，故标实多以血瘀居多，治法多以温阳补气为主[8]，兼以活血。黄芪性温，归脾、肺经，有补气升阳、行血通滞之功；附子性大热，归心、脾、肾经，有回阳救逆、补火助阳之功。二者相须使用则心气得温，心阳得补，心血得通，气虚之证得除。史君等[9]对近20年治疗CHF的方剂进行分析，结果显示，使用频率最高的中药为黄芪，附子排名第4位，可知黄芪-附子广泛应用于CHF治疗。

高血压、高血脂是心力衰竭的危险因素，心肌重构是心力衰竭发展的必然病理结果，炎症反应贯穿心力衰竭发生发展[10]。本文通过网络药理学方法，在TCMSP筛选黄芪-附子活性成分22个，在UniPort数据库获得相关靶点191个，药物-活性成分-靶点网络中度值较高的有槲皮素、 山柰酚、 7-Omethylisomucronulatol、异鼠李素、芒柄花素、3,9-di-O-methylnissolin、毛蕊异黄酮等。槲皮素、山柰酚、芒柄花素均为黄酮类化合物，槲皮素可通过多途径预防或延缓心力衰竭进程[11]，通过抑制血管紧张素Ⅱ降低心肌纤维化和心肌肥大，从而改善心肌重构[12-13]。山柰酚可通过调节核因子E2相关因子、核因子-κB和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路抑制心肌细胞凋亡，从而起到保护心脏作用[14]。芒柄花素可通过调节一氧化氮合成酶、5-羟色胺2A/1B受体和1-adrenoceptors表达降低血压[15]，抑制脂肪生成[16]。此外，β-谷甾醇[17]、异鼠李素[18]、脱氧乌头碱[19]等活性成分也能从多角度发挥延缓心力衰竭的作用。黄芪-附子治疗CHF度值较高的有效成分，如槲皮素、山柰酚、芒柄花素等可关联到PPI网络中评分较高的靶点，并且可富集到与CHF有关的通路。因此，推测以槲皮素、山柰酚、芒柄花素为代表的活性成分可能在CHF治疗中发挥重要作用。

核心靶点PPI网络中共有14个靶点，其中AKT1是AKT家族的成员之一，有实验表明，敲除AKT1基因小鼠，其胎儿死亡率显著高于对照组[20]，且存活小鼠心功能低于对照组。AKT1对心脏的影响主要表现为抑制心肌细胞凋亡，Kapustian等[21]研究表明，心力衰竭小鼠p-AKT1呈低表达，激活AKT1对CHF有一定治疗作用。MAPK14又称p38α，能被多种刺激因素激活，如白细胞介素（IL）-1、脂多糖、肿瘤坏死因子（TNF）-α、缺血、缺氧等[22-23]，MAPK14激活会引起心肌细胞肥大、凋亡或收缩功能障碍，Kompa等[24]观察MAPK14抑制剂对心肌梗死小鼠心肌纤维化、心肌肥大的影响发现，MAPK14抑制剂能改善心功能，减少心肌梗死后心脏重构，防止其进一步发展为心力衰竭。IL-6是一种多功能的细胞因子，大部分研究表明，其在CHF发展过程中表现为促进炎症发展作用[25-26]。Kobara等[27]研究表明，给予心肌梗死后小鼠IL-6拮抗剂可以抑制炎症，改善左心室重构。KEGG通路富集分析主要集中在PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路，其中PI3K-Akt信号通路富集的基因最多。PI3K-Akt信号通路是生物体内关键的通路，通过激活细胞内各种信号蛋白表现其生物学功能，包括细胞凋亡、转移、分化、代谢、蛋白质合成、细胞运动及囊泡转移等[28-29]，激活PI3Kα可促进TNF-β和miR-21表达，抑制心肌肥大[30]，激活PI3Kγ会损害心功能，降低心肌收缩力[31]。PI3K-Akt信号通路的下游靶点mTOR、GSK3、FoxOs 等亦参与心力衰竭的过程，有研究表明，mTOR抑制剂可抑制转化生长因子-β诱导的心肌纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白表达[32]，此外，RAGE能抑制PI3K-Akt信号通路，增加心肌细胞自噬，抑制RAGE对心肌细胞有保护作用[33]。由此推测，黄芪-附子治疗CHF可能与调控心肌细胞凋亡、改善心室重构有关，可能是以AKT1为靶点调控PI3KAkt信号通路改善心功能。

综上所述，黄芪-附子可能通过槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分，作用于AKT1、MAPK14等靶点，直接或间接调控PI3K-Akt、AGE-RAGE等多条信号通路，干预CHF的各个过程。体现了黄芪-附子通过多成分、多靶点、多通路治疗CHF的特点。