四味穿心莲散水煎剂防治禽致病性大肠杆菌病疗效研究

张利勃，单文琪，王宏军*，孙 健，田莉莉，蒋 红，刘国权

（1.锦州医科大学，辽宁锦州 121001；2.北京农业职业学院，北京房山 102400）

四味穿心莲散源自《中华人民共和国兽药典》，由穿心莲、大青叶、辣蓼和葫芦茶组成，具有清热解毒、涩肠止痢、抗菌消炎的作用，对禽致病性大肠杆菌（APEC）引起的鸡心包炎、肝周炎、气囊炎、卵黄性腹膜炎等有特效。汪艳秋等（2013）、班燕桃等（2020）采用薄层色谱法定性鉴别了四味穿心莲散中的大青叶；包爱情等（2016）用高效液相色谱法测定了四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量；张遂平等（2016）完成了四味穿心莲散固体分散体及其制备方法的研究；王林等（2017）采用薄层色谱法鉴别四味穿心莲超微粉中含有穿心莲内脂、脱水穿心莲内脂、靛玉红、芦丁及槲皮素；陶松若等（2020）开展了四味穿心莲散及其组方中单味中药水煎剂对沙门菌的体外抑菌试验。但目前关于四味穿心莲散抗大肠杆菌及其体内效果方面的研究鲜见报道，本试验将该复方的水煎剂用于APEC病的治疗，为鸡大肠杆菌病的治疗提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 大肠杆菌CVCC251购自于中国兽药药品监察所中国兽生物菌种保存管理中心。

1.1.2 药物 穿心莲、大青叶、葫芦茶和辣蓼均购买于国安市顺全隆中药材有限公司，经鉴定符合中华人民共和国兽药典要求。氟苯尼考可溶性粉，山东福美乐动物药业有限公司。

1.1.3 试剂 营养肉汤、营养琼脂、EC肉汤、琼脂粉、麦康凯琼脂，北京奥星生物技术有限责任公司。

1.1.4 试验动物 1日龄海兰褐雏鸡200只，购自锦州医科大学实验动物中心；雏鸡饲料，购自锦州东正饲料有限公司。

1.1.5 主要仪器 HC-1000Y型高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）；KQ-300B型超声波振荡清洗器（昆明市仪器有限公司）；双人双面净化工作台（SW-CJ-1FD，苏州净化）；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 DSCS的制备 将穿心莲、辣蓼、大青叶、葫芦茶4味中草药饮片粉碎，按照中国兽药典处方比例组方，加入10倍量水，超声处理30 min，煎煮2 h，收集滤液，然后再加入5倍量水煎煮1 h，重复一次，合并滤液，浓缩至1 g/mL药液。

1.2.2 抗菌活性的测定 将大肠杆菌CVCC251菌株冻干粉在EC肉汤增菌培养24～48 h，用徐淑云等（1994）提出的活菌计数调整细菌浓度为104cfu/mL，采用Jiang等（2013）提出的微孔-平板法测定提取物对试验菌株的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），每组试验重复3次。

1.2.3 APEC病理模型的建立 随机挑选180只10日龄雏鸡，按照蒋红等（2012）的方法攻毒制备APEC病理模型。按照陈溥言（2015）方法依据临床症状、病理剖检、显微观察及划线接种麦康凯琼脂平板，菌落呈红色即可初步诊断为鸡大肠杆菌病。

1.2.4 临床治疗试验 待动物表现明显症状时，随机分成5组，每组20只，设DSCS高剂量组（3 mL/只）、中 剂 量 组（1.5 mL/只）和 低 剂 量 组（0.5 mL/只），氟苯尼考可溶性粉组（1 mg/只），感染对照组（不给药组），另设一组健康对照组（不给菌不给药组）。连续给药5 d，停药后继续观察20 d，记录动物的临床表现、疾病发生、发展、转归和消失情况。按照《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》要求计算无效率、有效率、显效率、治愈率。

治愈率/%=（症状体征、实验室检查与专业特异指标均转为正常的动物数）/发病动物数×100；

显效率/%=满足以上其中三项的动物数/发病动物数×100；

有效率/%=（痊愈+显效动物数）/发病动物数×100；

无效率/%=100-有效率。

1.3 统计分析 用IBM SPSS Statistics 23软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌结果 四味穿心莲散水煎液对大肠杆菌CVCC251菌株的MIC为7.82 mg/mL，MBC为31.25 mg/mL。

2.2 治疗结果 由图1所示，氟苯尼考组动物治愈率、显效率、有效率及无效率分别为85%、90%、90%和10%，四味穿心莲散水煎剂治疗组治愈率为75%～90%，显效率为80%～95%，有效率为90%～95%，无效率为5%～10%。四味穿心莲散水煎剂高剂量组治愈率与氟苯尼考组有显著性差异（P＜0.05），中剂量组甚至略高于氟苯尼考组，表明中草药水煎剂组治愈APEC的疗效优于氟苯尼考，并且中草药水煎剂组的显效率、有效率和无效率与氟苯尼考组无显著性差异（P＞0.05）。后续跟踪观察发现，四味穿心莲散水煎剂组雏鸡的生长和抗病能力优于氟苯尼考组。

图1 四味穿心莲散水煎剂防治APEC结果

3 小结

鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠埃希氏菌（APEC）引起的一种细菌性传染病。该病多呈现混合感染、易产生耐药性，致使化药治疗十分困难，新致病菌株不断产生，疫苗又难以预防该病，因而寻求具有抗菌活性的中草药尤其是复方中草药用于大肠杆菌病的防治是新的突破口之一。目前，中草药治疗鸡大肠杆菌病成为研究热点，较多文献也报道单味中草药和一些方剂对大肠杆菌病有疗效，但存在发挥疗效的物质基础、作用机理不明确等问题。所以研究中草药抗菌作用应综合药物、微生物、机体相互关联因素，本试验应用APEC标准菌株考察四味穿心莲散水煎剂对APEC的抗菌活性，取得了较好的试验结果。随着中医药的发展、世界对中医药的认可及中医药国际化进程的推进，建立和完善我国药典和兽药典中收录的中草药成方制剂的质量控制、药理作用机制、药效物质基础等方面的研究势在必行。