一株系统抗性诱导细菌D8的鉴定及其对新疆加工番茄促生防病效果初探

林 青，史应武，王 玮，张丽娟，黄 伟，杨红梅，楚 敏，包慧芳，王 宁，霍向东

(新疆农业科学院 微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

新疆因得天独厚的光热资源优势，是全国最主要的加工番茄产区，番茄产量位居世界第三，被誉为新疆的“红色产业”[1]。然而，随着规模化生产迅速发展，连作和重茬使番茄病害种类逐渐增多，主要病害近20种，病情日趋严重，给新疆加工番茄生产造成巨大损失。因病原菌及发病条件差异，病害能发生在番茄的不同生长期和不同部位，并通过气流、雨水或随种子远距离传播，许多病原菌能在土壤病残组织或种子上越冬，或在干燥的种子上存活多年，有的甚至能侵染多种植物，造成在植株间反复多次侵染，使病害难以根除[2]。常规防治中，喷洒化学农药是最直接、快速、高效的手段，但农药的利用率普遍较低，不但污染环境，导致农药残留，影响人类身体健康，还会因连续施用致使病原菌产生抗药性[3]。研究表明，植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)不仅能通过固氮、溶磷、解钾、产生铁载体或植物生长调节剂等功能，帮助植物有效利用土壤养分并促进植物生长，还可对病原菌产生拮抗、竞争营养和生存空间，或诱导作物产生系统抗性实现生物防治作用[4]。诱导系统抗性(Induced systemic resistance，ISR)是有益微生物帮助植物自我防御的重要机制，可在植物局部识别激发子时触发，通过茉莉酸途径使植物级联成广谱系统反应[5]，因其无污染、广谱性、系统性、非特异性、不使病原微生物产生耐药性等特点，是作物病虫害防治的生态友好途径[6]。目前，各国学者已广泛在防治植物真菌病害、细菌病害、虫害[7]，病毒病害[8]，抑制果蔬采后病害[9]，耐盐胁迫[10]等方面开展了微生物诱导植物系统抗性的研究，并获得显著效果。Paenarthrobacternitroguajacolicus(也称Arthrobacternitroguajacolicus)是2004年报道的新种，能降解或转化硝基芳香族化合物[11]，在工业、医药、污染治理等领域具有广泛的应用价值[12]，但在植物促生防病方面的功能还在挖掘探索中。本研究探索P.nitroguajacolicus对新疆加工番茄的促生防病作用及机理，为开拓该菌株的应用领域和功能及新疆加工番茄病害的生物防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌株D8：前期工作中从新疆生产建设兵团农十二师104团2连蔬菜站(N:43°41′15.3″，E:87°27′34.7″)豆角根际土壤分离获得，现保存于新疆微生物资源保藏管理中心。

PDA 培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃高压灭菌20 min；营养肉汤(NB)、营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化钠5 g，(NA：琼脂15 g)，蒸馏水1 000 mL，pH 7.3± 0.1，121 ℃高压灭菌15 min。植物茉莉酸(JA)酶联免疫分析 (ELISA)试剂盒：江苏酶标生物科技有限公司；SK8255Ezup柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

茄链格孢菌Alternariasolani、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum由中国农业大学种子健康中心提供。加工番茄种子‘新番45号’(新红48号)由新疆农业科学院园艺作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌株D8的分子生物学鉴定 通过测定16S rDNA序列进行菌株的初步鉴定。采用 SK8255Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取菌株基因组 DNA，用通用引物27F、1492R扩增16S rDNA序列。PCR扩增反应体系为50 μL。PCR产物由北京鼎国昌盛生物科技有限公司纯化和测序，测得序列经NCBI BLAST比对分析。序列提交GenBank获得登录号。采用 MEGA 5 以邻接法(Neighbor Joining)构建系统进化树，bootstrap值1 000。

1.2.2 菌株D8对加工番茄生长的影响 菌液及菌悬液准备：将D8接种于NB培养基，于 37 ℃、180 r/min条件下振荡培养24 h，用平板菌落计数法确定菌液浓度。用无菌生理盐水稀释菌液至104倍数，菌液浓度为104cfu/mL，用于加工番茄种子浸种。将培养24 h D8菌液于9 000 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀菌体用清水重悬为浓度为109cfu/mL菌悬液，用于灌根处理。

对种子发芽的影响：选取饱满、均匀一致的加工番茄种子，参照赵伟进等[13]的方法进行表面消毒。以无菌生理盐水和稀释104倍的NB培养基为空白对照，将种子分别浸泡于稀释菌液和对照中，37 ℃吸附4 h，在超净工作台风干后，置于铺有用等量无菌水湿润滤纸的培养皿内，每皿10粒种子，每个处理重复3次，于28 ℃培养箱避光培养，3 d后调查种子发芽势，测量根长，5 d后调查种子发芽率，依据下列公式计算：

发芽势(Germination energy) =3 d 正常发芽的种子数/供试种子数 ×100%

发芽率(Germination rate) = 5 d正常发芽的种子粒数/供试种子数 ×100%

对幼苗生长的影响：用D8菌液对加工番茄种子进行两种处理：A用稀释菌液(104cfu/mL)进行浸种处理；B用菌悬液(109cfu/mL)进行灌根处理，以清水处理为对照。对照组和灌根处理组用生理盐水浸种，37 ℃保温4 h。分别在装有草炭∶蛭石=2∶1(体积比)基质的营养钵中，点播浸种后的种子，对照组和浸种组每钵浇清水100 mL，灌根组每钵添加15 mL菌悬液和85 mL清水。每个处理种10钵，重复3次。每5 d浇一次清水，每次浇100 mL/钵。待番茄长至三叶一心时，测量幼苗根长、株高和鲜质量。

1.2.3 菌株D8对加工番茄幼苗茉莉酸含量的影响 诱导接种：待番茄幼苗在草炭∶蛭石= 2∶1(体积比)基质长至三叶一心时，挑选长势、株高一致的幼苗，按“1.2.2”方法灌根。以清水处理为对照，每个处理10钵，重复3次。

茉莉酸含量的测定：灌根后每天采集番茄叶片，每天采集6钵，每株采集1片叶片，将叶片混合后分成3份，连续5 d，用植物茉莉酸(JA)酶联免疫分析 (ELISA)试剂盒，按说明书操作，测量番茄叶片茉莉酸含量。

1.2.4 菌株D8对加工番茄的防病效果 对峙试验：打取茄链格孢菌、灰葡萄孢菌菌落边缘直径为6 mm的菌饼，置于PDA培养基平板中心，从新鲜的D8 NA平板挑取单菌落点接于距病原菌中心2 cm的四周，置于30 ℃培养箱培养3～7 d；将青枯雷尔氏菌接种于NB培养基，37 ℃，180 r/min条件下摇瓶培养24 h，吸取100 μL菌液涂布于NA培养基上，晾干后在平板背面画十字，挑取菌株D8单菌落点接于距中心2 cm的4点处，置于37 ℃培养箱培养2 d。观察菌株生长情况。

病原菌制备：将茄链格孢菌、灰葡萄孢菌分别接种于装有50 mL PDA培养基的锥形瓶中，每株菌接种10瓶，于28 ℃培养箱培养7～14 d，待长出孢子，用无菌水在无菌条件下洗脱孢子，血球计数板计数，将浓度调整为106cfu/mL的孢子悬浮液。将青枯雷尔氏菌摇瓶培养，用平板菌落计数法确定菌液浓度为109cfu/mL。

诱导接种：方法同“1.2.3”。

挑战接种：诱导处理5 d后，分别将茄链格孢菌、灰葡萄孢菌孢子悬浮液和青枯雷尔氏菌液进行叶面喷施，接种后保湿48 h，培养室温度28 ℃，湿度RH≥90%。挑战接种第5天和第14天按如下方法统计病情指数和诱抗效果。发病程度分级标准见表1。

病情指数=∑(病级株数×代表数值)/(总株数×发病最重级的代表数值)×100%

诱抗效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%

表1 加工番茄早疫病、灰霉病和青枯病发病程度分级标准Table 1 Grade standard for incidence degree of gray mold, early blight and bacterial wilt of processed tomato

1.2.5 数据处理 采用WPS EXCEL 2016进行数据整理和绘图，IBM SPSS Statistics 20进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株D8的分子生物学鉴定结果

在 NCBI 网站对菌株D8的16S rDNA序列进行 BLAST 比对，利用 MEGA 5 软件构建系统发育树。结果表明，菌株D8与P.nitroguajacolicusG2-1相似性高达99.15%，系统发育树将2株菌聚为一类，亲缘关系最近，该菌种属于放线菌纲，微球菌科。因此初步将菌株D8鉴定为硝基癒疮木胶节杆菌(图1)。

图1 基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株D8对加工番茄生长的影响

2.2.1 菌株D8对种子萌发的影响 D8稀释菌液浸种处理的种子，根长为对照组的1.79和 1.85倍，发芽势提高了36.85%和85.71%，发芽率提高了38.10%和52.64%。与2组对照相比，菌株D8稀释菌液对加工番茄种子萌发有显著 (P<0.05)促进作用，能明显增加种子的根长，提高发芽势和发芽率(表2)。

表2 菌株D8对加工番茄种子萌发的促进作用Table 2 Germination of processed tomatoseeds promoted by strain D8

2.2.2 不同处理方式下菌株D8对幼苗生长的影响 与对照相比，浸种和灌根处理的幼苗生长更加茁壮，枝叶增多，根长增加，须根更多(图2)。2种处理下幼苗的根长比对照增加约3 cm，株高增加约2.5 cm。此外，浸种处理幼苗明显增加了须根和枝叶的数量，鲜质量是对照的2.95倍，是灌根处理的1.6倍。2种处理均能显著(P< 0.05)促进加工番茄幼苗生长(表3)。

图2 灌根(A)和浸种(B)处理方式下D8对幼苗生长的影响Fig.2 Effects of D8 on seedling growth under root irrigation (A) and seed soaking (B) treatments

表3 不同处理方式加工番茄的生长Table 3 Growth of processed tomato under different treatment methods

2.3 菌株D8对加工番茄幼苗内源茉莉酸含量的影响

茉莉酸是植物体内与抗病性密切相关的重要激素，与其他信号通路互作引发防御反应产生系统抗性，具有系统抗性诱导功能的PGPR会使植物内源茉莉酸水平升高[14]。图3中CK处理表明，加工番茄幼苗内源茉莉酸含量会随基质水分的变化而波动，呈现缺水时升高浇水后逐步降低的规律。在此基础上，D8菌悬液处理幼苗后前 2 d，明显缓解了缺水造成的茉莉酸含量升高，第3天水分充足情况下，处理组诱导了内源茉莉酸含量显著(P<0.05)升高，并能维持2 d。

柱形上方不同小写字母表示Duncan’s新复极差测验在 P<0.05差异显著

2.4 菌株D8诱导加工番茄系统抗性的防病效果

D8与3种病原菌在平板上共同生长，在交汇处均无抑菌带或抑菌圈出现，表明菌株D8对3种病原菌均无拮抗性(图4)。

A.灰葡萄孢菌;B.茄链格孢菌;C.青枯雷尔氏菌

菌株D8可诱导加工番茄内源茉莉酸水平升高，产生系统抗性，分别挑战接种病原菌后能显著(P<0.05)降低早疫病、灰霉病和青枯病的病情指数，在发病早期(5 d)对早疫病、灰霉病有很好的抗性，处理组病情指数仅为对照组的16.69%和7.98%，在挑战接种14 d，对3种病病原菌仍有28.77%～37.90%的诱抗效果(表4)。

表4 菌株D8对加工番茄病害的诱抗效果Table 4 Induced effects of strain D8 on processed tomato diseases

3 讨 论

病害多发是影响新疆加工番茄产业发展的重要难题之一[2]。原因主要有三：一是新疆目前栽种品种还没有对早疫病、疫霉菌、病毒病或细菌性病害的免疫或高抗品种，甚至有些还是感病或高感品种[15]；二是连作种植改变了土壤微生物群落结构，导致根际有益菌数量减少病原菌大量滋生，从而降低了加工番茄抵御病害的能力[16-17]；三是新疆为温带大陆性气候，每年6-8月气温高、降雨量大，加工番茄的无架栽培模式郁蔽程度大，高温高湿条件利于病原菌传播、侵染、繁殖[18]。为此，发生病害时应全面分析病因，采取选育抗病品种，消毒处理种子、苗床，加强田间管理，合理轮作，药剂施用等多种措施进行综合防治[19]。与化学农药相比，PGPR可通过调节植物代谢、改善根际营养环境、降解土壤污染物等多种途径促进植物生长、提高植株生活力、增强植物对病害或环境胁迫的抵抗能力，抑制植物病原菌生长，一些多功能的PGPR可发挥促生和生物防治的双重作用[20]，生物防治方法具有作用范围广谱、持效时间长效、不易产生抗药性及对生态环境安全等优点[21]，应用前景广阔。

Ludmila等[11]于2004年首次发现并报道了新种P.nitroguajacolicus，归类于节杆菌属。节杆菌属在代谢方面能力突出，一些物种具有代谢异生物质的能力[22]，如Paenarthrobactersp.A01可降解磺胺二甲嘧啶 (SMZ)，减少环境中磺胺类抗生素的污染[23]。P.aurescensTC1可降解除草剂莠去津[24]。节杆菌( Arthrobacter )对降解土壤中增塑剂邻苯二甲酸二正丁酯( DBP)具有广谱活性，可作为检测 DBP 污染的生物标志物及生物修复接种剂[25]。以往研究中P.nitroguajacolicus在不同领域也展现了多面的功能。A.nitroguajacolicusZJUTB06-99能产生腈水解酶将具生物毒性的丙烯腈生物转化为工业原料丙烯酸[26]。A.nitroguajacolicusRü61a能利用污染物喹哪啶(2-甲基喹啉)作为唯一的碳源和能源[27]。分离自韩国土壤的菌株P.nitroguajacolicus18J Y14-14和18JY15-11具有紫外线抵抗力，是未记录的抗辐射细菌[28]。伊朗金矿中分离的金属抗性菌株A.nitroguajacolicus，细胞外产生了球形的金纳米颗粒，平均尺寸为40 nm，可用于金纳米颗粒的绿色生物合成[29]。在植物促生保护方面，菌株P.nitroguajacolicus2-50能显著增加番茄生产性植株数，提高水利用率[30]。A.nitroguajacolicusE46通过形成生物膜，与其他4株细菌通过互补作用保护其宿主免受真菌植物病原体的侵害[31]。A.nitroguajacolicusYB3具有高效溶磷活性，A.nitroguajacolicusYB4、YB5能产生大量 IAA，在10 ℃时，YB4也能有效溶解磷酸盐，3株A.nitroguajacolicus菌株都有效增加了水稻品种 Swama 和 Swarna sub1的生物量和磷吸收[32]。

本研究菌株D8在低浓度菌液浸种处理下，即可显著促进加工番茄种子萌发和幼苗生长，提高幼苗鲜质量效果优于高浓度菌液灌根处理，在实际应用中极大减少了生产和时间成本。此外，菌株D8还能诱导加工番茄幼苗内源茉莉酸含量显著上升，产生系统抗性，在与3种病原菌均无拮抗作用情况下，能有效减轻加工番茄灰霉病、早疫病和青枯病病害，兼具促生防病功效，为新疆加工番茄病害防治提供了新的菌种资源和途径，同时也拓展了菌种P.nitroguajacolicus的生物功能。