尖锐湿疣动物模型及三维细胞培养模型研究进展

雷双旖,曾 抗

(南方医科大学南方医院皮肤科,广州,510515)

0 引言

尖锐湿疣( Condyloma acuminatum,CA) ,是由人乳头瘤病毒( human papillomavirus,HPV) 感染引起的以皮肤黏膜疣状增生性病变为主的疾病。自1954年以来,CA就被认为是一种独立的性传播疾病[1]。除此之外它也是一种已知病毒病因的良性肿瘤,并且具有一定恶变的潜力[2]。患者皮损最初体现为局部细小丘疹,随着时间进展逐渐增大或增多,发展为乳头状、菜花状、鸡冠状或团块状赘生物。一般无自觉症状,少数患者可因皮损位置原因出现瘙痒、异物感、压迫感等。皮疹部位可因赘生物脆性增加、摩擦而出现破溃、糜烂、继发感染等症状[3],影响患者的身心健康及生活质量。乳头瘤病毒(Papillomaviruses,PV)是在分化的皮肤细胞中繁殖的无包膜双链DNA病毒,呈高度多样化,可在其天然宿主的特定部位中引起良性肿瘤(疣、乳头状瘤),某些特定类型的PV诱导的乳头状瘤增生具有恶性进展的高风险[4]。由于种属特异性,人体是HPV唯一的自然宿主。目前普遍认为HPV感染仅限于粘膜皮肤复层上皮,病毒生命周期依赖于上皮细胞复制和分化,细胞周期的延续主要由PV E6和E7蛋白驱动,病毒颗粒在上皮细胞从上皮表面脱落并降解后释放[5]。所描述的400多种乳头瘤病毒中,218种与人类感染有关,其中约40多型与生殖器、肛周部位的感染有关。临床上根据HPV潜在的致癌性,将其分为低危型和高危型[6]。尖锐湿疣病变中大概率含有多种HPV类型,其中低危型HPV类型HPV6和HPV11在尖锐湿疣的发病机制中占主导地位,也可合并HPV16、HPV18等高危型HPV类型。Hawkins等[7]发现免疫抑制患者感染高危型HPV概率较健康人高,特别常见高危型的高风险HPV类型包括HPV16、HPV55和HPV59型。由于HPV体外难以通过传统细胞培养方式分离出大量病毒颗粒,又因其自然宿主局限于人,缺乏适宜的动物模型,这使人们对HPV的研究难以全面展开。近年来,随着HPV感染引起的性传播疾病和肿瘤的发病率逐年上升,HPV疫苗和HPV感染动物模型的研究与开发也受到越来越多的关注。人类在研究中使用动物模型已经持续了数千年,动物实验对药物的开发和理解人类疾病过程做出了重大贡献,但有时因不同的动物种属诱导疾病的模型与人类不相似、代谢途径和药物代谢物途径有差异、人类和被测试动物物种之间存在内在差异等原因使动物研究中得出的结论不能简单地转移到人类研究中[8]。随着分子生物学技术、基础细胞科学和组织工程的发展,三维细胞培养模型技术逐步完善,通过更准确地模拟体内微环境,弥补了传统二维单层培养和动物模型之间的差距[9]。

1 HPV相关疾病动物模型

1.1 哺乳动物PV感染动物模型

已建立的几种天然存在的动物乳头瘤病毒模型,例如,棉尾兔乳头瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus,CRPV)感染家兔模型、兔口腔乳头瘤病毒(rabbit oral papillomavirus,ROPV)感染家兔模型、犬口腔乳头瘤病毒(canine oral papillomavirus,COPV)感染犬模型和牛乳头瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)感染牛模型以及小鼠乳头瘤病毒( mouse papillomavirus type 1,MmuPV1)感染小鼠模型,CRPV是第一个鉴定的乳头瘤病毒,早期的PV相关疾病模型主要集中在CRPV和BPV1。1933年,Shope 等[10]在野生棉尾兔中观察到一种乳头状瘤,并发现其可传染给野生兔和家兔。1964年,Cheville[11]通过划痕接种牛疣组织导致牛接种部位上皮增生,通过皮下接种导致成纤维细胞增殖。Baker等[12]通过冷冻电子显微镜发现CRPV、BPV 1和HPV 1的玻璃质冰中的病毒颗粒具有基本相同的结构,进一步证实了CRPV和BPV1模型对HPV发病机制的适用性。CRPV与高危HPV的广泛遗传和功能同源性使该模型系统成为测试新型抗病毒和抗肿瘤治疗的金标准,在开发HPV疫苗、抗病毒药和抗肿瘤药方面发挥了关键作用[13]。由于牛和人类具有多种相似的免疫生理学特征,包括子宫内免疫系统的发育,这使得牛成为模拟人类免疫学的优秀模型。BPV也有多种亚型,体外研究的牛病毒的生命周期、基因组结构、病毒蛋白和病理生理学为了解人类病毒铺平了道路[14]。然而,CRPV仅感染皮肤部位,因此不是模拟肛门生殖器感染和疾病的理想模型[15]。在家兔感染模型中,CRPV产生的乳头状瘤不能适当支持完整的生产生命周期,并且产生很少或不产生感染性病毒颗粒[16]。与HPV不同,BPV E6和E7蛋白在生产性感染期间破坏细胞周期的作用较小,并且在更广泛的组织中复制[17]。除此之外,由于体积较大,生物学、遗传学与人类差别过大,以及病毒来源、实验试剂局限等原因,限制了这些感染模型的应用。与CRPV一样,COPV模型也进行了大量的疫苗开发工作,但由于饲养成本较高,且COPV不能感染生殖器组织,近年来该模型渐渐被ROPV模型所取代[18]。

2011年,在印度癌症治疗研究和教育高级中心的一群NMRI-Foxn 1(nu)/Foxn 1(nu)(裸)小鼠口鼻部黏膜交界处自发出现乳头状瘤,研究院分离得到MmuPV1,该病毒表现出嗜皮肤性,可感染免疫功能正常的小鼠背部皮肤[19]。之后Cladel等[20-21]发现MmuPV1在Foxn 1 nu/Foxn 1 nu小鼠阴道、宫颈、肛门、尿道、尾部、口鼻部、面部、内颊都易发生感染,并且可能具有恶性潜能。Spurgeon[22]实验证明了MmuPV1可通过性传播。至此MmuPV1感染小鼠模型被认为是研究肛门生殖器乳头状瘤病毒疾病的一种极具发展潜力的小动物模型。Wang等[23]发现MmuPV1感染小鼠的能力受到宿主免疫系统的强烈控制,MmuPV1可诱导用CD 3抗体去除T细胞的BALB/c或C57 BL/6小鼠产生乳头状瘤,并且瘤体可在免疫恢复的8周内完全消退,而单独CD 4+或CD 8 + T细胞耗竭均不足以产生可见的乳头状瘤。2020年Wei等[24]成功建立了第1个MmuPV1诱导头颈部鳞癌的体内感染模型。2021年Sauer等[25]通过MmuPV1感染有效地诱导NSG小鼠肛门高级别鳞状上皮内病变,并且实验表明在用UVB照射的免疫功能正常的FVB/NJ小鼠肛门,MmuPV1感染能持续长达6个月,提出了一种由自然感染驱动的肛门疾病和癌症的新模型。总而言之,虽然MmuPV1感染模型在概括人类感染和疾病的各个方面的能力存在固有的局限性[26],其仍具有令人难以置信的前景,MmuPV1的发现提供了一种实用且遗传学上易于处理的实验室动物物种背景下模拟HPV感染、传播和发病机制的动物模型。非人灵长类动物因其与人类的进化较为接近,也是研究HPV发病机制的有利模型,但在实验成本、技术、试剂等方面仍存在挑战。

1.2 HPV相关异种移植物模型

异种移植,即将一个物种的细胞组织移植到另一个物种体内。患者来源的异种移植物(Patient-derived xenografts,PDX),即将新鲜人肿瘤组织的细胞或完整片段移植到免疫系统中具有防止移植排斥的遗传缺陷的实验室动物(通常是小鼠),有助于体内抗肿瘤研究和筛选临床新型药物。1987年,Kreider等[27]将感染了HPV11的新生儿包皮的碎片移植到无胸腺小鼠的肾包膜下,建立了第1个HPV相关的异种移植模型。后续也有研究者利用相似方式构建出HPV40、HPVLVX 82/MM 7、HPV16的裸鼠/免疫缺陷小鼠肾包膜下/表皮下异种移植物模型[28-29]。1989年,Stanle等[30]尝试将含有高拷贝数HPV16 DNA的宫颈角质形成细胞系W12移植到无胸腺裸鼠上皮。次年Sterling等[31]同样将W12细胞系移植到裸鼠上,并成功诱导其形成复层分化上皮;长期移植显示出低度宫颈发育不良的组织学特征,终末分化细胞含有扩增水平的HPV-16 DNA、病毒衣壳抗原和病毒颗粒。Duan等[32]改良了Kreider的异种移植模型,以网状移植物模式接种,提高了模型低风险HPV的繁殖率和可重复性。2012年Kimple等[33]描述了一组HPV阳性和HPV阴性人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)肿瘤移植物模型,移植瘤具有典型的临床组织病理学标本的分化谱,并且在原始患者肿瘤和移植瘤之间具有高度的一致性。2018年,Larmour等[34]首次证明了新鲜宫颈癌、宫颈不典型增生和正常宫颈组织可以在高度免疫功能低下小鼠的肾包膜下生长,其中来自宫颈癌异种移植物的肿瘤在小鼠体内至少传代3次,重现了亲本肿瘤的结构和p16和HPV的免疫组化特征。

与癌细胞系或细胞系异种移植物相比,通过异种移植涉及人体组织的模型更适用于人类疾病。PDX模型在分子特征和治疗反应方面可能更接近其人类原始肿瘤,并且可能保留人类癌症典型的肿瘤间和肿瘤内异质性。尽管如此,仍需要确认已建立的PDX模型成功植入率,以及是否保留了原始人类肿瘤的特征,是否适用于进一步的研究[35]。但最近Kruse等[36]和Zottnick等[37]构建了一种新型MHC人源化小鼠原位HPV肿瘤模型。与现有的HPV 肿瘤模型相比,它适用于在排除鼠MHC呈递的表位的干扰下,研究HLA-A2和DR 1介导的免疫应答。A2.DR1小鼠经工程改造以缺乏所有鼠MHC分子,具有人MHC分子的排他性表达,因此可直接用于体内治疗性疫苗接种。Kruse等[36]通过用HPV 16 E6和E7转导A2.DR1肉瘤细胞系2277 NS产生E6+/E7+细胞系PAP-A2,并注射到A2.DR1小鼠的侧腹形成原位肿瘤。由于PAP-A2 luc细胞系中转导的HPV16蛋白表达水平较低且细胞存活不依赖于这些蛋白。Zottnick等[37]建立了一种新的E6+/E7+依赖性细胞系,用HPV 16 E6和E7转导A2.DR1衍生的肺细胞,用活化的癌蛋白H-ras G12 V转染细胞以使其致瘤,用萤火虫荧光素酶基因转染细胞使其能够被跟踪,该细胞系被命名为E6/7-lucA 2。将细胞系滴注到已同步到相同间情状态的小鼠阴道内。PAP-A2-luc细胞使3只小鼠中的2只形成阴道肿瘤,而E6/7-lucA 2细胞能够在所有3只小鼠中形成阴道肿瘤。Tseng等[38]和Peng等[39-40]也用HLA-A2(AAD)人源化小鼠构建HPV16 E6/E7口腔癌、头颈部鳞状细胞癌和HPV18 E7 E6宫颈阴道腺鳞癌模型。AAD转基因小鼠含有表达人HLA-A2的α1、α2结构域和源自小鼠的H-2Dd的α3跨膜胞质结构域的嵌合HLA I类分子,这种小鼠通常用于模拟人类T细胞HLA-A2呈递抗原的免疫应答。以上的肿瘤模型都可以形成自发的、局部的HPV致癌基因诱导的肿瘤,能跟踪从正常组织到侵袭性和/或转移性状态的进展,易于检测,可能适用于不同的人源化转基因小鼠,未来在测试各种疫苗和新型免疫疗法方面具有巨大的潜力。

尽管异种移植物模型的概念和初步建立已经存在了几十年,但随着个体化治疗方法改变癌症治疗,它们在肿瘤药物开发中的价值才刚刚实现,在增加人们对疾病生物学的理解,开发新的治疗方法和生物标志物方面,异种移植物模型仍是一个有吸引力的临床前替代癌症治疗模型。

1.3 HPV转基因动物模型

转基因技术是将期望的目标基因,经过人工分离、重组后,导入并整合到生物体的基因组中,从而改变生物原有的性状或赋予其新的性状。将基因导入哺乳动物的生殖系是生物学上重大技术进步之一。转基因动物在发育和发育基因调控机制、癌基因的作用以及免疫系统内复杂的细胞相互作用方面发挥了重要作用[41]。构建转基因动物模型克服了HPV的种属特异性这一缺点,通过组织特异性的外源启动子,使HPV癌蛋白定向表达在特定的组织细胞中。按 HPV 基因功能可分为早期区(E区)、晚期区(L区)和上游调控区(URR)3个区域(以HPV16为例):E区包括 E1～E7开放阅读框架,主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白;L 区分为 L1和L2的2个开放阅读框架,分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白;URR位于E区与L区间,负责复制和转录的调控,与 HPV 在人皮肤粘膜上皮的定向表达有关[42]。HPV16和HPV18是最常见的2种高危HPV,约占所有HPV相关宫颈癌和头颈癌的70%。占高风险HPV表达2种有效的癌蛋白E6和E7,分别介导细胞p53和pRb的降解,这2种肿瘤抑制蛋白对细胞周期控制和基因组稳定性至关重要,导致HPV诱导的癌变[43]。最初研究员们运用BPV-1研究乳头瘤病毒的转基因模型,发现BPV-1基因组通过小鼠生殖系传播导致皮肤纤维乳头瘤形成,并为HPV相关转基因小鼠的构建提供了理论基础[44]。人乳头瘤病毒的上游调控区(URR)又称长控制区(LCR)含有转录启动子和增强子元件,这些元件决定了病毒的细胞类型特异性。Yang等[45]将HPV 16基因组串联的头尾二聚体的形式与内源性HPV 16URR以显微注射到CD-1小鼠中。在没有其他干预的情况下,中年转基因鼠出现了多器官自发性恶性肿瘤,肿瘤发生在皮下、胸腔或腹部,一半小鼠出现肺、肝、肾、脑、淋巴结和脾中转移。肿瘤可在裸鼠体内移植并迅速生长。宫颈是女性HPV 16感染的主要部位,然而没有观察到宫颈的病变,Yang等考虑可能是由于E2区缺失/截短,或者动物没有存活足够长的时间来显示肿瘤。利用HPV调节区来驱动HPV癌蛋白的表达的研究并不顺利,肿瘤往往是非上皮来源的,且出现在非理想的靶器官中。于是研究者们尝试用异源启动子驱动癌蛋白的表达。

角蛋白K5和K14的表达通常局限于表皮基底层,表皮异常增生与这些标记物的超基础表达相关。表皮发育不良的增加与DNA合成增加,与角蛋白K5和K14出现在颗粒层,K10和微丝蛋白表达减少有关。角质形成细胞终末分化的标志物K10和微丝蛋白的表达降低,与上皮细胞分化的丧失一致[46]。人角蛋白14启动子(HK14)定位于各种复层表面上皮细胞的基底层表达,并驱动高水平的表达。1994年Arbeit等[47]为了模拟人乳头瘤病毒诱导的肿瘤进展,使用人角蛋白14(hK14)增强子/启动子将人乳头瘤病毒16型(HPV 16)的早期区域的表达靶向于转基因小鼠中鳞状上皮的基底细胞,建立了K14-HPV16进展型鳞状上皮肿瘤转基因鼠。小鼠耳、躯干皮肤、面部、口鼻部、眼睑以及肛门表皮和黏膜出现增生、乳头状瘤病和发育不良症状。K14控制的HPV癌蛋白转基因小鼠模型也已用于研究其他HPV类型蛋白的致癌潜力。在没有任何物理或化学致癌物治疗的情况下,HPV8转基因小鼠发生了非黑色素瘤皮肤癌[48]。Marcuzzi等[49]也发现,带有HPV 8的全部早期区域(CER)的转基因小鼠自发地发生皮肤的乳头状瘤、发育不良和鳞状细胞癌,另外几乎所有的HPV8 E6阳性小鼠自发地发生多灶性肿瘤,与HPV 8 CER小鼠相当,证明E6是诱导自发肿瘤发展至鳞状细胞癌水平所必需且足够的主要癌基因。当在小鼠子宫颈中给予雌激素时,K14 E7小鼠可发生宫颈癌,证明了E7癌蛋白与雌激素在小鼠宫颈中的强效共致癌活性[50]。除了K14启动子外,Borchers等[51]用人角蛋白10(hK10)作为启动子构建K10-HPV16-E6/E7转基因小鼠,并推断E7转基因表达在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)水平上诱导特异性免疫耐受。Michel等[52]也用K10构建在基底层上表达HPV20和HPV27 E6和E7蛋白的转基因SKH-hr 1无毛小鼠,并暴露于慢性UV照射,两品系小鼠表皮层和乳头状瘤形成的增殖增强,并发展成鳞状细胞癌。

以牛角蛋白6(bK6)基因为启动子也可产生表达HPV 16早期区基因的转基因小鼠,HPV 病毒的转录一般在基底上层被激活,且依赖细胞分化,bK6 E6/E7转基因小鼠中,E6/E7转录物在皮肤、子宫颈、十二指肠、胃和舌中过表达[53-55]。Crish等[56]用人外皮蛋白(hINV)启动子建立hINV-HPV16-E6/E7-SV 40转基因小鼠,导致棘皮症、角化不全和脱屑,小鼠的颊粘膜和舌上皮中也观察到过度增殖。hINV是一种上皮组织基底上层早期分化的标记,与角蛋白相比,外皮蛋白的表达水平相对较低,普遍认为该启动子比角蛋白启动子的活性低[42]。国内高慧等[57]以pCEP4载体为骨架,人巨细胞病毒(CMV)启动子启动下游基因表达,构建pCEP4-CMV-HPV16 E6/7真核表达质粒,通过受精卵显微注射法获得了可繁殖传代的整合了HPV16E6/7基因,可自行发生皮肤肿瘤的HPV转基因小鼠模型。为了模拟成年人HPV感染,最近研究人员构建了2种诱导型转基因模型,他莫昔芬[58]和多西环素[59]分别诱导表达K14-CreERTam和K5-rtTA启动子系统,诱导后癌基因E6和E7均高表达,导致表皮快速增生。

高危型HPV与癌症有关,且这些病毒编码的E6/E7癌蛋白已被证明在灭活p53和Rb方面更有效。上述研究都与高风险HPV不同亚型的癌蛋白的靶向作用相关。相比高危型HPV,低危型HPV转基因小鼠相关的研究较少。1992年Tinsley等[60]用角蛋白6(K6)基因的启动子区来调节转基因小鼠中HPV1早期区域的表达,HPV 1的存在与良性疣的形成有关,作者在小鼠爪、耳、背部皮肤和舌的上皮覆盖物中检测到HPV转录本。新生儿尾部皮肤变得坚硬,表面破裂成薄片,皮质层角化不全、角化过度,基底上层增生。爪和尾部的皮肤的上基底层中检测到E1-E4蛋白,转基因小鼠的角蛋白K6和K16水平升高,与其过度增殖状态一致,其表现与人类病毒疣观察到的相似。最终小鼠的皮肤在出生后3周内恢复正常,没有观察到良性或恶性乳头状瘤。Schenkel等[61]利用HPV11自身URR作为启动子,并观察到报告基因的毛发特异性转录。Michel等[52]构建K10-HPV27-E6/E7转基因小鼠在慢性UV照射下发展成鳞状细胞癌。

总的来说,低危型HPV癌蛋白的表达不产生稳定的表型改变,而高危型HPV癌蛋白的表达产生稳定和进行性疾病。不同的组织特异性启动子在发育过程中的不同时间被激活,表达HPV癌蛋白,靶向组织方面HPV自身启动子不如异源启动子成功。在多种转基因小鼠,小鼠呈现出相似或相矛盾的表型,有的还需要各种辅因子促进致癌进展。每种品系都有其自身的潜力和局限性。但转基因动物模型允许选择性地去除特定免疫途径中的不同分子、其他细胞致癌基因和肿瘤抑制基因,通过减少或增加其抗肿瘤活性和/或其促肿瘤信号,有助于进一步研究HPV的致病机理和开发新的预防和治疗措施。

2 HPV相关三维细胞培养模型

HPV在最初感染基底细胞后,HPV DNA扩增并建立为低拷贝数的染色体外基因组,HPV基因组与宿主基因组一起复制。作为细胞分化周期的一部分,受感染的细胞从基底膜脱离并进入基底上皮层。病毒E6和E7蛋白的表达促进非预定的细胞周期进展,支持连续的病毒复制。随着细胞继续分化,E1和E2蛋白的表达增加导致向生产性病毒DNA扩增过渡。最后,病毒衣壳蛋白L1和L2在上皮的终末分化层内合成,完成病毒体组装。这意味着HPV的生命周期是分化依赖性的,需要重现三维复层上皮[62]。以下主要介绍3种三维细胞培养模型,器官型筏式培养模型、多细胞球体模型、类器官模型。

器官型筏式培养模型由Asselineau和Prunieras[63]开发,是公认能代表上皮组织的三维细胞培养模型,角质形成细胞被置于含或不含成纤维细胞的真皮等同物(例如去表皮皮肤、胶原蛋白或基质胶)的顶部,通过在空气-液体界面中支架上培养来实现分化和分层。由于角质形成细胞培养物“漂浮”在空气/液体界面处,故这种上皮细胞培养物通常被称为“筏”培养物。该模型形成的复层和分化的上皮,为研究人员提供了研究嗜上皮病毒的有用手段,已应用在研究HPV-癌症/其他病毒相互作用、HPV生命周期、HPV的传播及感染、评估HPV治疗的有效性等方面,在体内观察到的HPV-宿主相互作用已被证明与该模型中的表现类似[9]。器官型筏式培养模型是迄今为止HPV研究中的一个重要里程碑。建立人原代上皮细胞的三维器官型培养模型步骤如下,第1步使用成纤维细胞(可使用永生化的人包皮成纤维细胞系或原代人成纤维细胞)和胶原蛋白建立真皮等同物;第2步将角质形成细胞的基底层接种到含有活性成纤维细胞的真皮等同物上;第3步将“筏”提升到空气-液体界面,及将“筏”转移到一个预湿的膜插入物上,该膜插入物位于6孔板中分化培养基的表面上。然后使组织分化1—3周,进行完全上皮分层。目前研究人员开发了来自肛门生殖道、口咽和皮肤上皮的人类HPV相关粘膜恶性肿瘤的体外三维器官型培养模型[64-65]。从健康或肿瘤相关角质形成细胞和成纤维细胞来源的组织建立的器官型培养模型在体外概括了其天然对应物的组成和结构组织(上皮分层、功能性基底膜、成纤维细胞聚集的基质、复合细胞外基质),能更好地阐明致癌过程中基质和上皮间室之间的相互作用,代表了用于研究肿瘤进展和评价非动物模型中的联合疗法的新模型[66]。

球状体是研究肿瘤的有力的模型,因为它们概括了肿瘤细胞的细胞间信号传导途径和生长动力学,产生球体的基本概念是促进细胞相互作用,在附着表面或支架上聚集并经历自组装,在这个过程中,单一分散的细胞形成三维微组织,它具有与人类肿瘤组织接近的表型特征[67]。最常用的模型是多细胞肿瘤球体模型,1970年Sutherland等[68]就开始培养多细胞肿瘤球体。构建球状体可以使用培养基和特殊方法避免细胞粘附在容器表面,比如转瓶法,通过持续搅拌防止细胞附着在容器表面,促进细胞与细胞接触,该方法相对简单,能产生大量球状体,但具有高剪切力并且细胞大小和数量不可控[69]。悬滴法,依赖于重力在倒置的基底上形成球状体,该方法价格低廉,球体大小可控,但大规模生产受到限制[70]。液体覆盖法,用非粘附材料处理,防止细胞附着于组织培养板并促进球状体形成,该方法简单、产量高,但球状体的大小和形状是不均匀的。转壁式生物反应器(RWV)法,反应器可使细胞在悬浮液中水平旋转,产生微重力,并促进细胞聚集成球状体,该方法提供低流体剪切环境和促进细胞生长和随机化重力矢量的最小湍流[71],但设置较复杂,成本较高。磁悬浮法,用铁或金氧化物处理细胞,再用磁铁将它们悬浮在介质中,促进球体的形成,该方法能快速生成球体,但成本过高,金属纳米颗粒也可能会干扰球体的相关实验。除了运用特殊方法避免细胞粘附外,还可以运用基质促进球体生长,其提供细胞-细胞以及细胞-基质相互作用,细胞悬浮接种在基质包被的平板上方或包埋在基质内。天然来源的基质更能代表肿瘤微环境,因为它们类似于实体瘤的基质成分,最常用的是胶原蛋白或基质胶,除此之外还可用成纤维细胞衍生基质、丝素蛋白、藻酸盐、透明质酸等。合成基质如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)和聚ε-己内酯(PCL)可自行定制培养所需的生长因子、细胞因子等添加剂,与天然基质相比,这些基质更均匀,但生理学适用性较差[72]。

类器官是三维细胞培养技术的最新发展成果,可用于通过引入疾病突变或使用患者来源的人多能干细胞来模拟疾病,模拟疾病的类器官可以用作药物测试的替代系统,可以更好地再现人类患者的治疗效果,甚至可能运用到组织替代疗法。类器官是从干细胞或器官祖细胞发育而来的器官特异性细胞类型的集合,并以类似于体内的方式通过细胞分选和空间限制的谱系定型进行自组织[73]。这使得类器官能够比任何其他类型的三维细胞培养物更有效地复制亲本组织的基因型和表型,甚至能够刺激体内细胞外囊泡的形成和分泌[74]。类器官并非没有缺陷,其最常用的培养基质为基质胶,基质胶来自小鼠肉瘤,不能完全重现人体组织微环境。但这个问题已经有所改善,研究者将类器官与免疫细胞、基质细胞或生态位细胞的分泌组分共培养,以模拟人体组织微环境条件[75]。其次并非所有原代细胞都可以容易地培养为类器官,类器官生成也是一个相当昂贵的过程。目前人类多能干细胞生成三维类器官仍处于起步阶段,迄今为止,人类多能干细胞已经被诱导产生肠、肾、脑、视网膜、子宫颈等类器官,子宫颈类器官提供了一个新的平台,以研究HPV驱动的宫颈癌发展[73.76],但随着三维细胞培养技术和组织再生技术的飞速发展,相信在不久的将来,人类类器官会变得更加成熟且多样化。

3 总结

尖锐湿疣由HPV感染引起,导致人肛门和外生殖器的皮肤黏膜赘生物生成。HPV6和HPV11在其发病机制中占主导地位,若由HPV16、HPV18等高危型HPV感染引起,则伴有一定恶变潜力。在以上所描述的动物模型和三维细胞培养模型中,MmuPV1感染小鼠模型可以模拟HPV感染、传播和引起人类肛门生殖器乳头状瘤的发病机制,是研究尖锐湿疣极具潜力的模型之一。异种移植物模型虽然在研究初期有着移植物存活时间短、成功率低、缺少模拟HPV感染及发病过程等缺点,但随着转基因人源化小鼠和种类增多和异种移植技术的成熟,尖锐湿疣异种移植物模型仍可作为其他模型在免疫应答方面的替代或补充。各种高危型和低危型HPV癌蛋白转基因小鼠模型,也有助于研究HPV引起尖锐湿疣的致病机制,促进相关疫苗和治疗措施的开发。各种三维细胞培养模型有各自的优势和缺陷,但足以满足研究HPV的整个分化依赖性生命周期,包括病毒体形态发生、病毒生长、感染、发病机制和病毒-宿主相互作用等,相比动物模型来说更适合研究嗜上皮病毒,在伦理问题、费用、处理方法以及将研究结果从非人类模型转化为临床方面都要更有优势。总而言之,随着三维细胞培养技术的改善,这些模型将成为研究人员研究尖锐湿疣和相关治疗方案的主要平台。本片文章分类总结了HPV相关疾病动物模型和三维细胞培养模型,研究者可参考各模型优缺点,根据实验需求选择适合的模型。