多基因甲基化检测对宫颈癌及癌前病变筛查的价值

吴欣瑜，向 睿，吴雪辉，王静依，孟 侠，李 薇，吴 垠

1)成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院妇产科 成都 610051 2)成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院超声医学科 成都 610051

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的妇科常见恶性肿瘤，因其较高的发病率和病死率，宫颈癌筛查备受临床关注[1]。早期实现精准筛查有利于宫颈恶性病变的尽早诊断和治疗，是预防宫颈癌、降低宫颈癌病死率的关键。宫颈病变筛查方式中，巴氏细胞学检测受限于样本条件，易漏诊；液基薄层细胞学检测(thinprep cytologic test，TCT)可重复性差，诊断结果易受病理学医师主观影响，敏感度较低[2]；而高危型人乳头状瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)-DNA检测则受HPV一过性感染的影响，特异度较低[3]。随着肿瘤发病机制研究的进展，临床发现肿瘤的发生受表观遗传学影响，可通过检测肿瘤相关基因的甲基化程度进行筛查[4]。已有研究[5-6]显示，多基因甲基化检测在非小细胞肺癌、大肠癌等癌症筛查中具有良好效能。基于此，本研究分析比较了TCT、HR-HPV-DNA检测、多基因甲基化检测在宫颈癌及癌前病变中的筛查效能，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象纳入2019年1月至2021年6月于成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院行宫颈癌筛查的癌变高风险女性124例，年龄21～70(36.7±10.5)岁。纳入标准：①有性生活。②就诊时存在不同程度的阴道流血、阴道分泌物增多等症状。③年龄≥18岁。④能够配合完成本研究所需进行的相关检测。⑤对研究知情同意。排除标准：①有宫颈手术史。②有肿瘤病史或合并严重心脑血管疾病、系统性疾病等。③存在急性生殖道炎症或其他妇科疾病史。④检测前3 d有性生活或进行阴道给药、妇科检查等操作。⑤检查时处于月经期、妊娠期或哺乳期。

1.2 标本采集①TCT、HR-HPV-DNA、多基因甲基化检测标本：检查医师常规暴露患者宫颈并仔细清理宫颈口分泌物，通过在宫颈口旋转专用采样刷刷取脱落上皮细胞，于细胞保存液中保存细胞。②病理学检测标本：检查医师常规暴露患者宫颈并仔细清理宫颈口分泌物，在阴道镜下观察宫颈，对可疑部位多点取宫颈活检组织，采集的组织固定于体积分数10%甲醛溶液中送检。

1.3 TCT标本经病理科常规处理，由病理科医师在光学显微镜下读片、诊断。参照国际癌症协会TBS分级诊断标准[7]，分为正常细胞或炎症病变、未确定意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)和腺癌，其中正常细胞或炎症病变诊断为阴性，ASCUS及以上分级诊断为阳性。

1.4 HR-HPV-DNA检测与联合诊断采用HC2 HR-HPV-DNA检测技术进行检测。根据样本/标准阳性对照的相对光单位结果进行诊断，当二者比值≥1.0即HR-HPV-DNA阳性，反之即阴性。TCT联合HR-HPV-DNA诊断为并联诊断，即二者检测结果中有任何项为阳性即判定阳性。

1.5 多基因甲基化检测常规提取标本DNA，检验纯度和浓度；DNA经重亚硫酸氢盐化学修饰，进行6个独立的甲基化特异性实时荧光PCR，选择性扩增甲基化的DNA区域，检测仪器为美国Applied Biosystems 7000扩增仪，检测试剂盒购自国药集团上海杰诺生物科技有限公司。反应条件如下：93 ℃ 2 min，93 ℃ 50 s、55 ℃ 60 s，10个循环；93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s，40个循环。6个标志物为ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671。ZNF671阳性计0.5分，ASTN1、ITGA4、RXFP3、SOX17阳性各计0.2分，DLX1阳性计0.1分，综合评分取各评分之和，≥0.5判断为阳性。

1.6 病理学检测活检组织标本送至病理科，常规制片，制片时每张玻片上连续取片3～6片，由2名病理科医师盲法阅片诊断。病理诊断[8]分为炎症病变、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和SCC，其中炎症病变诊断为阴性，其余分级诊断为阳性。

1.7 统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析。TCT、HR-HPV-DNA、多基因甲基化检测的诊断效能以病理学结果(金标准)为参照计算，通过Kappa值进行组间一致性评价。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TCT、HR-HPV-DNA、多基因甲基化检测结果与病理学检测结果比较与病理学检测结果比较病理学诊断，124例患者中阳性86例(含CINⅠ 32例、CIN Ⅱ 25例、CIN Ⅲ 21例、SCC 8例)，阴性38例；TCT阳性73例，阴性51例。病理学诊断中的6例炎症病变者经TCT诊断为ASCUS 5例和LSIL 1例，14例CIN Ⅰ和5例CIN Ⅱ 患者经TCT诊断为正常细胞或炎症病变。HR-HPV-DNA检测阳性81例，阴性43例；病理学诊断中的8例炎症病变者经HR-HPV-DNA检测诊断为阳性，8例CIN Ⅰ和5例CIN Ⅱ 患者经HR-HPV-DNA检测诊断为阴性。多基因甲基化检测阳性85例，阴性39例；病理学诊断中的2例炎症病变者经多基因甲基化检测诊断为阳性，3例CIN Ⅰ者经多基因甲基化检测诊断为阴性。见表1。

表1 124例宫颈癌筛查癌变 高风险女性的TCT、HR-HPV-DNA、 多基因甲基化检测结果与病理学检测结果比较 例

2.2 各检测方法在宫颈癌筛查中的诊断效能宫颈癌及癌前病变筛查中，TCT、HR-HPV-DNA二者联合检测的效能优于TCT或HR-HPV-DNA单项检测效能；多基因甲基化检测的诊断效能较TCT联合HR-HPV-DNA检测更优，与病理学结果一致性高。见表2。

表2 TCT、HR-HPV-DNA、TCT联合HR-HPV-DNA以及多基因甲基化检测诊断宫颈癌的方法学评价

3 讨论

女性机体的免疫防御系统能够识别并清除体内入侵的HPV，这一相对短暂的感染过程即HPV一过性感染，这一情况下出现的感染并不会导致宫颈恶性病变，宫颈持续性的HR-HPV感染才是宫颈癌发病的主要原因，而一般从HPV感染发展为宫颈恶性病变需要超过10 a的时间[9]。因此女性定期进行宫颈癌筛查具有重要意义，尤其是年轻女性的宫颈癌筛查不容忽视。

在宫颈癌筛查中，TCT经高密度过滤膜可将采集标本中的杂质过滤分离，使得制片后宫颈上皮细胞能够单层均匀分布，相较于传统的直接取材涂片大大提高了诊断效能，但该方法仍受取样准确性、染色技术、病理科医师阅片的主观性等因素影响，假阴性较高[10]。本研究宫颈癌及癌前病变筛查中，TCT敏感度为77.91%，特异度为84.21%，均未达85%，Kappa值为0.567，与病理结果一致性仅为中等，且敏感度偏低，即假阴性偏高。而大部分宫颈癌患者的病理样本中均可检出HPV，由此可通过HR-HPV-DNA检测进行宫颈癌筛查。但女性感染HPV后发展至宫颈癌需经历潜伏感染期、亚临床感染期、临床症状期和HPV相关肿瘤期多个阶段，在各感染阶段均可通过HR-HPV-DNA检测技术检出HPV，而处于潜伏感染期、亚临床感染期的部分感染者并未出现癌性或癌前性的病理损害，这意味着HPV感染一过性会使这一检测方法的特异度降低，影响宫颈癌筛查的准确性[11]。本研究中，HR-HPV-DNA检测在宫颈癌及癌前病变筛查中的诊断敏感度为84.88%，特异度为78.95%，Kappa值为0.616，与病理结果一致性较高，但特异度偏低。为进一步提高宫颈癌筛查的准确性，临床可联合TCT结果与HR-HPV-DNA检测结果进行判断。本研究结果显示，宫颈癌及癌前病变筛查中，TCT和HR-HPV-DNA联合筛查敏感度和特异度分别为89.53%和89.47%，Kappa值为0.762，与病理结果一致性较高，提示联合筛查可进一步提高诊断效能，与既往研究[12]结果相符。其原因是TCT结果可弥补HR-HPV-DNA检测在病理形态诊断方面的不足，而HR-HPV-DNA检测又可为TCT结果补充HPV病毒活性的信息，二者互相取长补短。

肿瘤通常由遗传学和表观遗传学改变的积累引起，检测特定基因的表观遗传学变化可作为肿瘤筛查手段，而基因甲基化是最常见的表观遗传学标志，现阶段临床研究较多[13]。宫颈组织中的基因甲基化分为宿主基因和HPV基因的甲基化两类，HPV基因甲基化可阻止其被机体免疫识别、清除而实现持久的感染状态；宿主基因中的抑癌基因超甲基化会造成抑癌基因失活或转录遏制，原癌基因低甲基化会导致癌基因活化或再表达，两种基因甲基化异常均会诱导癌变发生[14]。根据以上机制，临床通过基因异常甲基化检测能够实现肿瘤的早期诊断。目前关于宫颈癌基因甲基化的国内研究多为单基因研究，虽然国外已有应用多基因甲基化检测技术进行宫颈癌筛查的报道，但由于国内外宫颈癌的发病情况存在差异，多基因甲基化检测在我国宫颈癌筛查中的应用价值仍需进一步验证。本研究选用的多基因甲基化检测试剂盒涉及ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671，该试剂盒检测技术经欧盟认证，对宫颈癌具有较高敏感度和特异度。本研究结果显示，多基因甲基化检测在宫颈癌及癌前病变筛查中的诊断敏感度、特异度分别为96.51%、94.73%，其诊断效能与国外研究[15]结果一致，均明显高于TCT、HR-HPV-DNA检测及二者联合检测，提示多基因甲基化检测在宫颈癌及癌前病变筛查中具有极高的应用价值。但值得注意的是，多基因甲基化检测步骤较为繁琐、检测费用相对较高，在基层医院中普及仍存在困难，可将其作为TCT、HR-HPV-DNA检测及二者联合检测外的辅助诊断方法，由此在减少漏诊的同时避免不必要的活检，减轻患者身体负担。

综上所述，多基因甲基化检测用于宫颈癌及癌前病变诊断的效能较高，值得临床推广。