肺炎克雷伯菌的喹诺酮类耐药株gyrA 基因研究

郭丽娜 王家欣 姚文 刘琦琦

目前,用于治疗由肺炎克雷伯菌所致感染的抗菌药物包括碳青霉烯类、头孢菌素类、β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等。其中,喹诺酮类抗菌药物具有抗菌谱广、抗菌作用强、生物利用度高、组织渗透性好、不良反应较少等优点,受到临床重视。然而随着喹诺酮类药物的广泛应用,耐喹诺酮类肺炎克雷伯菌的出现已非常普遍［1,2］,有资料显示肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物耐药主要是由DNA 回旋酶的A 亚基的gyrA 基因突变引起变异［3］,且存在地域差异［4］。为了解本地区肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制,共收集43 株耐喹诺酮类药物的临床菌株,采用PCR 检测gyrA 基因,扩增产物纯化后测序,进而探讨其相关耐药机制。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院2017 年1 月～2018 年12 月期间临床样本分离的肺炎克雷伯菌的喹诺酮类耐药株43 株,其中痰液21 份,尿液6 份,静脉血5 份,穿刺液5 份,胆汁4 份,腹水2 份。标本留取规范,送检及时,剔除不符合送检标准者(痰标本涂片镜检应符合：白细胞>25/LP,上皮细胞<10/LP),结合涂片和培养结果,剔除污染菌。菌株均经Phoenix 100 全自动细菌鉴定系统鉴定,鉴定相似度>99%。

1.2仪器与试剂 Phoenix 100 全自动细菌鉴定系统(美国BD 公司)；引物及测序由通用生物系统(安徽)有限公司完成；PCR 扩增试剂及琼脂糖购自北京瀚海康泰医药科技有限公司；Eppendorf PCR 仪；凝胶成像仪［上海勤翔(Clinx)］；OMEGA 切胶纯化试剂盒。

1.3药敏试验 采用Phoenix 100 革兰氏阴性细菌药敏板进行药敏试验,试验结果判断参考美国临床和实验室标准协会(Clinicai and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)标准。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922,铜绿假单胞菌ATCC 27853,标准菌株购自卫生部临床检验中心。

1.4基因检测模板制备 采用碱裂解液法,将1.5 ml 37℃过夜纯培养的细菌于4℃ 10000 r/min 离心2 min,收集菌体,重悬于500 μl dd H2O 溶液中,95℃水浴20 min 后,4℃10000 r/min 离心5 min,保留上清液,-20℃保存备用。

1.5PCR 检测gyrA 基因 PCR 扩增体系：模板1.5 μl,上游和下游引物各1 μl,Primer STAR Max 25 μl,dd H2O 21.5 μl,共50 μl。PCR 扩增程序为：95℃预变性5 min,接着95℃30 s →58℃30 s →72℃45 s,共35 个循环,最后72℃延长5 min。按照OMEGA 切胶纯化试剂盒说明书进行PCR 产物纯化。纯化后的产物送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序,测序结果与肺炎克雷伯菌的标准gyrA 基因序列进行比对。本文PCR 检测所用的引物序列见表1。

表1 PCR 检测所用引物序列

2 结果

2.1肺炎克雷伯菌gyrA 基因PCR 检测结果 43 株肺炎克雷伯菌gyrA 基因的PCR 扩增均得到目的片段,扩增产物长度为441 bp,与文献［5］报道一致。部分菌株PCR 产物的电泳图及gyrA 基因扩增结果见图1。

图1 部分菌株PCR 产物的电泳图及gyrA 基因扩增结果图

2.2肺炎克雷伯菌gyrA 基因测序结果 所检测的喹诺酮类耐药株的gyrA 基因序列与肺炎克雷伯菌标准gyrA 基因序列进行比对,其基因突变情况见表2。

表2 gyrA 基因突变比对结果

3 讨论

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科重要的细菌之一,常引起医院和社区感染,且检出率呈逐年上升的趋势［6］,可引起肺炎、泌尿系感染、菌血症、手术切口及其他部位感染［7］。近年来有研究表明：喹诺酮类药物在临床上被广泛使用,肺炎克雷伯菌对这类药物耐药率呈逐年升高趋势［8-10］。

喹诺酮类药物作用的靶位是细菌的DNA 回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ,DNA 回旋酶在DNA 复制,转录过程中起重要作用,可使松弛的DNA 链形成超螺旋结构,此酶是由2 个gyrA 基因编码的gyrA 亚基和2 个gyrB 编码的gyrB 亚基组成的四聚体,其中任何一个亚基的突变都有可能造成喹诺酮类药物耐药。喹诺酮决定区域位于第67～106 位氨基酸［5］,其中第83 位丝氨酸的极性对确定细菌对喹诺酮药物敏感性非常重要［11］。本文43 株肺炎克雷伯菌耐喹诺酮菌株均出现了gyrA 亚基第83 位氨基酸的改变,Ser83→Ala 或Ser83→Thr,这一结果与国内其他研究者如徐陶等［12］存在不同,可能由菌株流行的地域差异导致,由极性氨基酸丝氨酸变成了非极性氨基酸丙氨酸,使第83 位位点亲水性降低,DNA 回旋酶与喹诺酮类药物亲和力下降,从而表现为对该类药物耐药［3］。本文中有20 株肺炎克雷伯菌发生了极性氨基酸丝氨酸→苏氨酸的突变,提示gyrA 基因突变与超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的获得相关,是肺炎克雷伯菌产生多重耐药的主要机制之一［13］。

除了本文中研究的gyrA 基因突变与肺炎克雷菌耐喹诺酮株耐药机制相关,质粒介导的水平传播亦可造成菌株对喹诺酮类药物耐药,由质粒介导的ESBLs 基因、AmpC 酶基因和喹诺酮类药物耐药基因可能存在同一质粒或同一转移元件中,携带多种耐药基因的质粒或转移元件水平传播,可能造成对一种药物耐药的同时,伴随着其他药物也呈现高耐药表达,这些问题课题组将在下一阶段研究中证实。

综上所述,肺炎克雷伯菌的喹诺酮类耐药株gyrA基因突变非常普遍,监测其突变频率及特点对研究喹诺酮类耐药机制和指导临床合理用药非常必要。