白背叶楤木中的有机酸衍生物及甾醇类化学成分

钱海珊，普津姣，王 娟，李红芳，陈 帅，李绍花，李宝晶，3*，何红平，3*

（1. 云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500；2. 西双版纳傣族自治州傣医医院，云南 西双版纳 666100；3. 云南中医药大学云南省南药可持续利用研究重点实验室，云南 昆明 650500）

白背叶楤木（Aralia chinensis L. var. nuda Nakai）傈僳语称为“里俄籽”，为五加科楤木属药食两用植物，味甘、微苦，性平，归肝、胃、肾经，具有活血化瘀、祛风利湿之功，用于治疗风热咳喘、痢疾、黄疸、风湿痹痛等[1]。楤木属多分布于亚洲，少数分布于北美洲。我国楤木属植物资源较为丰富，有29 种，尤以云南和四川的种类最多，约占全国种类总数的三分之二[2]。楤木属植物的化学成分主要为三萜皂苷、三萜、二萜、黄酮、有机酸及其衍生物等[3]，并显示良好的抗炎、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、心肌保护以及中枢抑制等作用[4-8]。近年来，白背叶楤木在怒江傈僳族地区推广种植，但其化学成分研究较少，课题组前期对白背叶楤木化学成分进行了初步探索[9-10]，为了进一步研究开发具有民族特色的药用资源白背叶楤木，我们对其乙酸乙酯部位中有机酸衍生物及甾醇类化学成分进行研究，从中分离并鉴定了14 个有机酸衍生物及甾醇类化合物。

1 仪器与材料

Bruker Avance 400 和600 MHz 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1260 infinity 液相色谱仪（美国Agilent 公司）；IKA 旋转蒸发仪（艾卡（广州）仪器设备有限公司）；薄层硅胶G254 和柱色谱硅胶（100～200 目、200～300 目）（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶（美国GE 公司）；RPC18 色谱填料（美国EMD Millipore 公司）；石油醚、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、乙酸（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中科院上海细胞库）；DMEM 培养基、胎牛血清购自BI 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Griess 试剂、N-单甲基-L-精氨酸单乙酸酯（NG-monomethyl-L-arginine acetate，LNMMA）、MTS 试剂均购自美国Sigma 公司；NO 检测试剂盒（032519190612，碧云天生物技术有限公司）；细胞CO2培养箱、超净工作台（赛默飞世尔科技有限公司）。

白背叶楤木样品于2019 年4 月采集于云南省怒江傈僳族自治州泸水县鲁掌镇，由怒江泸水县河新楤木种植农民专业合作社种植提供，凭证标本（201904SM）存放于云南中医药大学云南省高校中药民族药质量标准研究重点实验室。由云南中医药大学中药学院李艳平教授鉴定为白背叶楤木A. chinensis L. var. nuda Nakai 的干燥芽苞部位。

2 提取与分离

将20 kg 白背叶楤木芽苞粉碎，70%乙醇浸提3次，合并滤液后减压干燥得到4.7 kg 提取物浸膏，用水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩干燥后得到乙酸乙酯部位600 g。乙酸乙酯部位经100～200 目硅胶柱层析，以石油醚-丙酮（100 ∶1，v/v）梯度洗脱，TLC 检测，合并后得到10 个流分Fr.A～J。

流分A（31.0 g）经200～300 目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯（1 ∶0，v/v）梯度洗脱，TLC 检测合并得到5 个流分Fr.A1～A5。Fr.A1 经RP-C18 反相色谱柱甲醇-水（8 ∶2，v/v）洗脱后重结晶得到化合物1（22.8 mg），2（6.5 mg），9（6.0 mg），11（68.5 mg）。Fr.A2 经RP-18 反相色谱柱甲醇-水（1 ∶9，v/v）梯度洗脱后重结晶得到化合物3（4.4 mg）、4（13.9 mg）、5（110.0 mg）、10（19.6 mg）、12（34.3 mg）。Fr.A3 经硅胶柱层析，以石油醚洗脱得到化合物8（11.1 mg）。Fr.A4 经RP-C18 反相色谱柱甲醇-水（9 ∶1，v/v）洗脱后得到化合物6（9.9 mg）。

流分D（89.8 g）经200～300 目硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，TLC 检测合并得到5 个流分Fr.D1～D5。Fr.D1 经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯（600 ∶1，v/v）洗脱得到化合物7（4.0 mg）。Fr.D2 经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇（18 ∶1，v/v）洗脱得到化合物13（22.9 mg）和14（20.8 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，C15H32O，ESI-MS m/z：227[M-H]-。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.64（2H，t，J=6.6 Hz，H-1），1.56（2H，m，H-2），1.26～1.34（24H，m，H-3～14），0.88（3H，t，J=6.8 Hz，H-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：63.2（C-1），33.0（C-2），32.1（C-3），29.9（C-4），29.9（C-5），29.9（C-6），29.9（C-7），29.8（C-8），29.8（C-9），29.8（C-10），29.6（C-11），29.5（C-12），25.9（C-13），22.8（C-14），14.3（C-15）。上述数据与文献报道[11]一致，因此鉴定化合物1 为十五烷醇。

化合物2：白色片状结晶，C34H70O，ESI-MS m/z：493[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 3.64（2H，t，J=6.6 Hz，H-1），2.33 （1H，t，J=7.5 Hz，-OH），1.56（2H，m，H-2），1.18～1.42（62H，m，H-3～33），0.87（3H，t，J=6.8 Hz，H-34）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：63.3（C-1），33.0（C-2），32.2（C-3），29.3～29.9（C-4～30），26.0（C-31），24.9（C-32），22.9（C-33），14.3（C-34）。上述数据与文献报道[12]一致，因此鉴定化合物2 为三十四烷醇。

化合物3：白色粉末，C15H30O2，ESI-MS m/z：241[M-H]-。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：2.34（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.62（2H，m，H-3），1.20～1.35（22H，m，H-4～12），0.88（3H，t，J=6.9 Hz，H-15）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），32.1（C-3），29.2～29.9（C-4～12），24.8（C-13），22.9（C-14），14.3（C-15）。上述数据与文献报道[13]一致，因此鉴定化合物3 为十五烷酸。

化合物4：白色粉末，C17H34O2，ESI-MS m/z：269[M-H]-。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：2.34（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.64（2H，q，J=7.5 Hz，H-3），1.16～1.45（26H，m，H-4～14），0.88（3H，t，J=6.6 Hz，H-17）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：180.8（C-1），34.3（C-2），32.1（C-3），29.2～29.9（C-4～14），24.8（C-15），22.9（C-16），14.3（C-17）。上述数据与文献报道[14]一致，因此鉴定化合物4 为十七烷酸。

化合物5：白色片状结晶，C20H40O2，ESI-MS m/z：311[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.35（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.64（2H，m，H-3），1.20～1.34（32H，m，H-4～19），0.88（3H，t，J=6.9 Hz，H-20）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：179.8（C-1），34.1（C-2），32.1（C-3），29.2 ～29.9（C-4 ～17），24.8（C-18），22.9（C-19），14.3（C-20）。上述数据与文献报道[15]一致，因此鉴定化合物5 为二十烷酸。

化合物6：无色油状物，C32H62O2，ESI-MS m/z：477[M-H]-。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.33（1H，tq，J=7.1，1.3 Hz，H-2'），4.59（1H，d，J=7.1 Hz，H-1'），2.27（2H，t，J=7.1 Hz，H-2），2.00（2H，t，J=7.1 Hz，H-4'），1.62（2H，t，J=7.1 Hz，H-7），1.50（1H，m，H-11），1.41（2H，m，H-9），1.38（2H，m，H-6，H-8），1.28（2H，m，H-3），1.25～1.26（20H，m，H-5'～14'），1.22（2H，m，H-4），1.15（2H，m，H-5），1.08（2H，m，H-10），0.88（3H，d，J=6.4 Hz，CH3-6），0.86（6H，d，J=6.8 Hz，CH3-11×2），0.86（3H，t，J=6.8 Hz，H-16'），0.84（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-8）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：174.1（C-1），142.8（C-3'），118.3（C-2'），61.4（C-1'），40.0（C-4'），39.5（C-15'），37.6（C-9），37.5（C-14'），37.5（C-13'），36.8（C-10），34.6（C-2），33.0（C-8），32.8（C-6），32.1（C-4），29.9（C-12'），29.8（C-11'），29.8（C-10'），29.6（C-9'），29.5（C-8'），29.4（C-7'），29.3（C-6'），28.1（C-11），25.2（C-7），25.0（C-3），24.6（C-5'），22.9（C-6），22.8（C-5），19.9（C-11），19.9（C-12），16.5（C-3'），14.3（C-8）。上述数据与文献报道[16]一致，因此鉴定化合物6 为balansenate Ⅰ。

化合物7：无色油状物，C11H20O4，ESI-MS m/z：215[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CD3OD）δ：3.65（6H，s，-OCH3×2），2.32 （4H，t，J=7.4 Hz，H-2，H-8），1.60（4H，p，J=7.3 Hz，H-3，H-7），1.32（6H，q，J=4.0 Hz，H-4～6）；13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ：176.0（C-1，C-9），52.0（-OCH3×2），34.7（C-2，C-8），30.0（C-4～6），26.0（C-3，C-7）。上述数据与文献报道[17]一致，因此鉴定化合物7 为壬二酸二甲酯。

化合物8：黄色油状物，C19H32O2，ESI-MS m/z：291 [M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.28～5.43（6H，m，H-9 ～10，H-12 ～13，H-15 ～16），3.66（3H，s，OCH3），0.97（3H，t，J=7.5 Hz，H-18）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：174.5（C-1），132.1（C-16），130.4（C-9），128.4（C-12），128.4（C-13），127.9（C-10），127.3（C-15），51.6（-OCH3），34.3（C-2），29.9（C-7），29.3（C-6），29.3（C-5），29.2（C-4），27.4（C-8），25.8（C-11），25.7（C-14），25.1（C-3），20.7（C-17），14.4（C-18）。上述数据与文献报道[18]一致，因此鉴定化合物8为α-亚麻酸甲酯。

化合物9：白色鳞片状结晶，C28H58O，ESI-MS m/z：409[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：3.52（2H，t，J=6.8 Hz，H-1），1.47（2H，p，J=6.8 Hz，H-2），1.10～1.37（50H，m，H-3～27），0.81（3H，t，J=6.8 Hz，H-28）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：62.6（C-1），32.6（C-2），31.9（C-26），25.8（C-3），29.4～29.7（C-3～25），22.7（C-27），14.1（C-28）。上述数据与文献报道[19]一致，因此鉴定化合物9 为二十八烷醇。

化合物10：白色粉末，C16H32O2，ESI-MS m/z：255[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.34（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.62（2H，p，J=7.5 Hz，H-3），0.87（3H，t，J=6.9 Hz，H-16）；13C NMR （125 MHz，CDCl3）δ：180.4（C-1），34.2（C-2），32.1（C-3），29.9（C-4），29.8（C-5～9），29.6（C-10），29.5（C-11），29.4（C-12），29.2（C-13），24.8（C-14），22.9（C-15），14.3（C-16）。上述数据与文献报道[20]一致，因此鉴定化合物10 为十六烷酸。

化合物11：白色针晶，C29H48O，ESI-MS m/z：411[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.34（1H，d，J=5.4 Hz，H-6），5.14（1H，dd，J=15.2，8.7 Hz，H-22），5.01（1H，dd，J=15.2，8.7 Hz，H-23），0.97（3H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.87（3H，t，J=7.0 Hz，H-29），0.84（3H，d，J=6.5 Hz，H-26），0.81（3H，d，J=4.4 Hz，H-27），0.80（3H，s，H -19），0.69 （3H，s，H -18）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：140.8（C-5），138.3（C-22），129.3（C-23），121.7（C-6），71.8（C-3），56.9（C-14），56.0（C-17），51.3（C-24），50.2（C-9），42.3（C-13），42.2（C-4），40.5（C-20），39.7（C-12），37.3（C-1），36.5（C-10），32.0（C-25），31.9（C-7，C-8），31.6（C-2），28.9（C-16），25.4（C-28），24.4（C-15），21.2（C-21），21.1（C-11，C-26），19.4（C-19），19.0（C-27），12.3（C-29），12.1（C-18）。上述数据与文献报道[21]一致，因此鉴定化合物11 为豆甾醇。

化合物12：白色鳞片状结晶，C35H58O6，ESI-MS m/z：573[M-H]-。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.16（1H，dd，J=15.4，8.4 Hz，H-23），5.11 （1H，s，H-7），5.01（1H，dd，J=15.4，8.4 Hz，H-22），4.93（1H，d，J=8.6 Hz，H-1'），4.45（2H，m，H-3'，H-4'），4.20（1H，d，J=7.7 Hz，H-2'），4.13（1H，m，H-5'），3.63（1H，d，J=11.6 Hz，H-6'），3.16（1H，m，H-3），0.99（3H，d，J=8.5 Hz，21-CH3），0.90（3H，d，J=6.6 Hz，29-CH3），0.82（3H，d，J=6.8 Hz，26-CH3），0.80（3H，d，J=6.8 Hz，27-CH3），0.73（3H，s，19-CH3），0.50（3H，s，18-CH3）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：139.0（C-8），138.3（C-22），130.0（C-23），117.1（C-7），101.4（C-1'），79.5（C-3），76.8（C-5'），76.6（C-3'），76.1（C-2'），73.3（C-4'），62.5（C-6'），56.1（C-17），54.8（C-14），50.5（C-24），49.5（C-9），45.0（C-13），41.7（C-5），38.2（C-12），37.3（C-1），36.7（C-20），36.7（C-4），36.1（C-10），33.7（C-25），31.2（C-20），29.1（C-2），29.1（C-6），28.5（C-16），26.4（C-28），23.8（C-15），22.4（C-11），21.0（C-26），20.8（C-21），19.8（C-27），12.7（C-19），12.0（C-29），11.7（C-18）。上述数据与文献报道[22]一致，因此鉴定化合物12 为α-菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物13：白色粉末，C35H58O6，ESI-MS m/z：573[M-H]-。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.29（1H，s，H-6），4.87（1H，d，J=4.5 Hz，H-23），4.85（1H，d，J=4.5 Hz，H-22），4.19（1H，d，J=7.8 Hz，H-1），3.61（1H，m，H-3），0.97（3H，s，H-18），0.96（3H，s，H-19），0.87（3H，d，J=6.3 Hz，H-21），0.79（6H，d，J=6.7 Hz，H-26，H-27），0.63 （3H，t，J=8.2 Hz，H-29）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：140.5（C-5），138.1（C-22），128.9（C-23），121.2（C-6），100.9（C-1'），77.0（C-3），76.8（C-3'），73.5（C-2'），70.1（C-4'），61.1（C-6'），56.3（C-14），56.2（C-17），55.4（C-5'），50.7（C-9），49.7（C-24），45.2（C-13），41.8（C-20），41.8（C-12），38.4（C-4），36.9（C-1），36.3（C-10），33.9（C-25），31.4（C-7），31.4（C-8），29.3（C-2），29.3（C-16），25.0（C-28），24.9（C-15），22.7（C-11），21.2（C-21），21.0（C-27），21.0（C-19），19.8（C-26），12.0（C-18），11.8（C-29）。上述数据与文献报道[23]一致，因此鉴定化合物13 为豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物14：白色粉末，C29H50O，ESI-MS m/z：413[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.35（1H，m，H-6），3.51（1H，m，H-3），2.27（1H，m，H-25），2.19（2H，m，H-4），1.71（1H，m，H-17），1.25（1H，m，H-14），1.24（1H，m，H-9），1.21（1H，m，H-8），1.12（1H，m，H-24），0.99（3H，s，H-19），0.91（3H，d，J=6.8 Hz，H-21），0.82（3H，d，J=6.9 Hz，H-26），0.80（3H，d，J=6.9 Hz，H-27），0.67（3H，s，H-18）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：141.1（C-5），122.1（C-6），72.1（C-3），57.2（C-17），56.4（C-14），51.6（C-9），46.1（C-24），42.7（C-13），42.6（C-4），40.1（C-12），37.6（C-1），36.9（C-10），36.5（C-20），34.3（C-22），32.3（C-8），32.2（C-7），32.0（C-2），29.4（C-2），28.6（C-25），28.6（C-16），24.7（C-23），23.4（C-15），21.4（C-28），20.2（C-18），19.8（C-11），19.4（C-26），19.3（C-19），19.2（C-27），12.4（C-21），12.2（C-29）。上述数据与文献报道[24]一致，因此鉴定化合物14 为β-谷甾醇。

4 抗炎活性筛选

一氧化氮（nitric oxide，NO）具有广泛而重要的生物学调控功能，当免疫细胞受LPS 等炎症介质刺激时诱导型NO 合成酶被激活，从而合成大量的NO，进而诱导炎症损伤。因此，抑制NO 生成是抗炎活性的直接指标。

RAW264.7 细胞使用DMEM 完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞接种至96 孔板（1×105个/孔），设置正常对照组、模型组（LPS）、阳性对照组（L-NMMA）、单体化合物组。加入LPS（1 μg/mL）对细胞进行刺激，同时加入阳性药或待测单体化合物（50 μM），培养24 h，收集细胞上清液，使用NO 检测试剂盒，在570 nm 下测定吸光值。以MTS 测定细胞存活率，排除化合物对细胞毒的影响。

结果显示，在50 μM 浓度下，阳性药L-NMMA的NO 生成抑制率为（52.01±1.96）%，化合物8、12的NO 生成抑制率分别为（87.46±2.00）%、（1.32±1.30）%。

5 结果与讨论

本研究从白背叶楤木乙酸乙酯部位中分离纯化得到14 个化合物，化合物1～8、11～14 均为首次从该植物中分离得到，其中，化合物1～8、11～13 为首次从楤木属植物中分离得到，化合物2～7、12～13 为首次从五加科植物中分离得到。体外抗炎活性筛选发现，化合物8 在50 μM 浓度下的NO 生成抑制率为（87.46±2.00）%，抗炎效果优于阳性对照L-NMMA，但其具体机制还需要进一步探索。文章进一步丰富了白背叶楤木的化学成分，可为后期抗炎药物的开发提供基础。