多囊卵巢综合征患者颗粒细胞蛋白质组学分析

焦芸云，宋宁，王苑，方星瑜，宋文妍

(郑州大学第一附属医院生殖医学中心，郑州 450052)

多囊卵巢综合征(PCOS) 是育龄期女性常见的生殖与代谢性疾病，其主要的临床特征包括促性腺激素分泌失调、高雄激素血症、胰岛素抵抗和卵泡发育不良等[1]。虽然辅助生殖技术已成为PCOS排卵障碍性不孕症的常用治疗方法，但由于PCOS患者内分泌紊乱和代谢失调导致的卵泡发育异常，在接受IVF/ICSI治疗时常出现卵母细胞成熟度低和卵母细胞质量差的问题[2]。同时，PCOS女性发生流产、早产等不良妊娠结局及2型糖尿病、子宫内膜癌等疾病的风险也显著高于正常人群[3]。因此，深入研究PCOS发生的分子机制，具有重要的临床和社会价值。

颗粒细胞围绕于卵母细胞周围，通过缝隙连接、旁分泌等多种方式与卵母细胞相互作用。颗粒细胞分泌的蛋白质、类固醇和多糖等物质是卵泡液的重要成分，为卵母细胞的生长发育提供了适宜的微环境。先前关于PCOS的蛋白质组学研究大多集中于血清和卵泡液，Insenser等[4]认为，研究PCOS患者颗粒细胞中的蛋白质表达变化或许可以帮助我们更清楚地了解PCOS的发病机制。因此，我们进行了蛋白质组学分析，鉴定PCOS患者颗粒细胞中的差异表达蛋白，初步分析差异蛋白在PCOS发生中的作用。

材料与方法

一、研究对象

选择2020年9月至2021年9月于我院生殖医学中心行IVF/ICSI助孕的患者共24例，其中PCOS组12例和正常排卵对照组12例，收集取卵后废弃卵泡液并提取颗粒细胞。

PCOS的诊断参照2003年鹿特丹诊断标准。

对照组为因输卵管因素或男方因素不孕的非PCOS女性。纳入标准：月经周期规律，基础体温双相；超声检查卵巢无多囊样改变；基础内分泌正常。

两组排除标准：子宫内膜异位症；卵巢功能减退及卵巢发育不良；其他导致排卵障碍的全身性疾病，如高泌乳素血症、甲状腺疾病、Cushing 综合征等；染色体异常。

本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理审查编号：2022-KY-0157-002)。所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.颗粒细胞提取：收集取卵日卵泡穿刺液，根据已发表文献所述方法[5]，采用密度梯度法分离卵泡液中颗粒细胞。将卵泡液于室温下以1 500 r/m离心15 min，弃上清，用预热的PBS(磷酸缓冲盐溶液)重悬细胞沉淀。将细胞悬液以1∶1的比例缓慢加到人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝)顶部，室温下以2 000 r/m离心20 min。离心后管中液体从上至下分为3层，小心吸取中间白色雾状层至新的离心管中。用预热的培养基洗涤颗粒细胞2次，将其放入37℃、5%CO2培养箱中培养2 d以去除混杂的血细胞。

2.液相色谱-串联质谱分析：每组各取3例颗粒细胞样本，提取蛋白，使用BCA试剂盒(北京索莱宝)测定蛋白浓度。对蛋白质进行胰蛋白酶酶解，除盐后真空干燥。采用TMT标记试剂盒(Thermo，美国)对肽段进行6重TMT标记，然后通过高效液相色谱系统进行分离。缓冲液A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液，缓冲液B为含0.1%甲酸和80%乙腈的水溶液。将样品以300 μl/min 的流速上样到C18分析柱(Agilent，美国)上进行梯度洗脱。缓冲液梯度设置：0～55 min，8% B；55～79 min，30% B；79～80 min，50% B；80～90 min，100% B。采用Q Exactiv质谱仪(Thermo，美国)进行质谱分析。以70 000的分辨率进行一级质谱扫描，质谱全扫描范围为300～1 600 m/z。选择其中10个最高峰对肽段母离子进行二级质谱扫描。自动增益值设置为2E5，离子最大累积时间为80 ms，动态排除时间设为15 s。

3.蛋白质鉴定与生物信息学分析：采用Proteome Discoverer 2.2 软件在Uniprot人类数据库中对质谱原始数据进行检索，并对检索结果进行统计学分析。差异蛋白的筛选标准：①差异倍数>1.2 或<0.83；②P<0.05。为了进一步探索差异蛋白的生物学功能，我们采用OmicsBean组学数据分析系统，对差异蛋白进行了基因本体(GO)功能注释分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路注释分析，采用Cytoscape软件在STRING数据库中进行蛋白质相互作用(PPI)分析。

4.Western Blot：另取PCOS组和对照组各9例样品，每组中的3例随机混合，形成3组生物学重复；从差异蛋白中随机选取4个蛋白(LDHA、YY1、AFP和LZTS1)，采用Western Blot法对蛋白质谱结果进行验证。步骤如下：将蛋白质样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到PVDF膜上，与5%的脱脂牛奶共同孵育1 h；将PVDF膜分别与鼠抗LDHA(ab112996；Abcam，英国)、兔抗YY1(ab109228；Abcam，英国)、兔抗AFP(WL03819；沈阳万类)、兔抗LZTS1(ab226335；Abcam，英国)及鼠抗α-Tubulin(11224-1-AP；武汉三鹰)一抗(均为1∶1 000稀释)在4°C孵育过夜；用TBST(含Tween 20 的盐酸缓冲液)清洗PVDF膜3次后，加入HPR标记山羊抗兔及山羊抗鼠二抗(武汉三鹰)，在室温下孵育1 h；再次清洗PVDF膜3次，使用增强型化学发光检测试剂盒(Affinity，美国)进行显影，并通过Image Lab(6.1)软件进行定量。

三、统计学分析

对每组各个标本的蛋白质谱原始定量值进行log 2转换，使数据满足正态分布。使用SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用t检验对定量数据进行组间比较，以P<0.05为具有统计学意义。

结 果

一、患者基本临床特征

本研究共纳入PCOS患者(PCOS组)和正常排卵的非PCOS患者(对照组)各12例。两组间抗苗勒管激素(AMH)水平、基础LH水平及基础LH/FSH比值均显著高于对照组(P<0.05)，Gn总剂量显著低于对照组(P<0.05)；其余临床资料无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 PCOS组和对照组基本临床资料(-±s)

二、 蛋白质鉴定与生物信息学分析

通过在Uniprot人类数据库中对质谱原始数据进行检索，并对检索结果进行统计学分析。结果显示，PCOS组表达上调的蛋白共169个，包括SERBP1和VDBP等；下调蛋白160个，包括PDH、ENO1、PGAM1、PFKP、PDHX、LDHA、CPPED1、SFGH、GST和LZTS1等。表2和表3分别列出了前20个上调蛋白和下调蛋白。

表2 差异倍数排名前20的上调蛋白

续表

表3 差异倍数排名前20的下调蛋白

GO注释分析结果表明(图1)，这些差异表达的蛋白质主要参与化学响应、胁迫响应和细胞激活等生物过程；主要参与的细胞组成为胞外囊泡、胞外外泌体和胞外空间等；主要的分子功能为蛋白结合、poly(A) RNA结合和蛋白同源二聚体活性等。

图1 差异表达蛋白GO富集分析柱状图

对差异蛋白进行KEGG富集分析，图2展示了前20条显著富集的生物学通路，包括缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸分解，丙酮酸代谢，糖酵解/糖异生，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，脂肪酸代谢，谷胱甘肽代谢，补体和凝血级联反应等。表4列出了显著性排名前10的KEGG通路及参与该通路的差异蛋白。PPI分析结果展示了差异蛋白间的相互作用网络(图 3)。本研究的蛋白质谱原始数据已上传至ProteomeXchange数据库，可从通讯作者处获得。

图2 差异表达蛋白KEGG信号通路富集分析气泡图

表4 差异蛋白参与的显著性排名前10的生物学通路

图3 差异表达蛋白的相互作用网络

三、差异蛋白表达水平验证

Western Blot结果(图4)显示，PCOS组中的下调蛋白LDHA和LZTS1的表达水平显著低于对照组(P<0.05)，而上调蛋白YY1和AFP的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，与蛋白质组学的结果一致。

A：LDHA；B：YY1；C：AFP；D：LZTS1；与对照组比较，*P<0.05。图4 Western Blot检测两组患者LDHA、YY1、AFP和LZTS1蛋白表达水平

讨 论

本研究对PCOS患者卵巢颗粒细胞进行了蛋白组学分析。KEGG分析结果表明，差异蛋白在多条代谢相关的生物学通路中显著富集，如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解，糖酵解/糖异生，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，脂肪酸代谢等。多种参与糖酵解/糖异生过程的酶如PGK1、PGK2、ENO1、PGAM1、PFKP、PDHX和LDHA在PCOS组中显著下调。卵母细胞对葡萄糖的利用能力差，卵泡生长所需的能量主要由颗粒细胞通过糖酵解提供[6]，糖酵解过程异常可导致颗粒细胞供能不足，影响卵泡生长及卵母细胞成熟。支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)不仅是人体必需的能源物质，还可作为信号分子调节糖脂代谢[7]。先前的研究表明，支链氨基酸代谢异常与肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生密切相关，血清支链氨基酸水平可影响PCOS胰岛素抵抗的发生和进展[8]。人体无法合成支链氨基酸，只能从外界摄取，所以体内支链氨基酸平衡的维持主要依靠其分解代谢。PCOS颗粒细胞内支链氨基酸代谢异常，不仅影响卵泡中蛋白质的合成，还可影响葡萄糖和脂肪酸代谢，干扰卵泡微环境中的代谢稳态。综上所述，本研究的结果表明PCOS颗粒细胞内存在葡萄糖、脂肪酸及多种氨基酸的代谢紊乱，推测这些代谢异常可造成卵巢环境的改变，进而影响卵泡发育和卵母细胞成熟。

本研究显示，与对照组比较，PCOS组中钙调样磷酸酯酶结构域包含蛋白1(CPPED1)表达下调。在PI3K/AKT信号通路中，Ser473的磷酸化对于AKT1的激活是必不可少的，而 CPPED1可使Ser473去磷酸化，导致AKT1激活受阻[9]。研究发现，在成熟脂肪细胞中敲低CPPED1可促进胰岛素刺激的葡萄糖摄取，并上调参与葡萄糖代谢基因的表达水平[10]。我们推测，PCOS患者颗粒细胞中CPPED1表达下调或许可能干扰PI3K/AKT的信号传导，影响葡萄糖代谢。有研究者发现，与选择性剖腹产相比，自然分娩中胎盘CPPED1 mRNA表达量显著降低，但两组AKT1的磷酸化水平并无差异[11]，提示CPPED1可能具有不同的功能。深入探索CPPED1在PCOS发病中的作用，或许可为PCOS发病机制的研究提供新的方向。

本研究发现PCOS组SERBP1蛋白的表达明显增加。SERBP1是纤溶酶原激活物抑制剂1 RNA结合蛋白，表达于颗粒细胞的细胞膜和细胞质中。在卵泡发育过程中，孕酮通过与孕酮膜受体(PGRMC1)结合，抑制颗粒细胞的有丝分裂和凋亡[12]。研究发现SERBP1可作用于PGRMC1，调节孕酮对颗粒细胞的作用，敲除SERBP1后，孕酮抗颗粒细胞凋亡的能力明显减弱[13]。国外有学者发现，与排卵规律的女性相比，PCOS女性卵巢颗粒细胞的凋亡率显著降低[14]。我们推测，PCOS中SERBP1的高表达或许可减少颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞的增殖、分化和凋亡，伴随着卵泡的发育、成熟和闭锁，研究者认为卵泡闭锁减少导致卵泡积聚可能是PCOS发病机制之一[15]。因此进一步研究SERBP1在PCOS卵泡发育中的功能，或许可为PCOS发病机制的阐明提供帮助。

本研究中KEGG分析显示，差异蛋白在谷胱甘肽代谢途径中显著富集，涉及的蛋白如S-甲酰谷胱甘肽水解酶(SFGH)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)等，在PCOS组显著下调。SFGH催化S-甲酰谷胱甘肽转化为谷胱甘肽(GSH)，在GSH的生物合成中发挥重要作用。GST催化GSH与亲电子化合物结合，是体内活性氧(ROS)代谢系统的重要成员。卵泡的生长伴随着活跃的物质代谢，随着卵泡的发育，其对能量的需求逐渐增加，ROS的产生也随之增多。谷胱甘肽代谢系统异常可导致卵泡中的活性氧不能被有效清除，使细胞遭受氧化应激(OS)的损害。研究发现，OS参与PCOS发病的多个方面，包括排卵障碍、胰岛素抵抗(IR)和高雄激素血症等[16]。PCOS患者卵泡液中ROS的蓄积可抑制卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的形成，导致卵母细胞减数分裂停滞[17]。从谷胱甘肽代谢途径入手，或许可为PCOS的治疗提供新的思路。

维生素D结合蛋白(VDBP)是一种多功能球蛋白，其主要功能是与维生素D及其代谢产物结合，调节维生素D的分布和代谢。循环中大部分维生素D都以与VDBP结合的形式存在，仅少部分为具有生物学活性的游离维生素D，VDBP水平的变化，可影响维生素D的结合状态和游离维生素D的水平。我们的结果显示，PCOS组颗粒细胞中VDBP的表达水平明显高于对照组。同时有研究者发现，PCOS患者尿液中VDBP的表达水平也显著高于正常人群[18]。PCOS患者中普遍存在维生素D缺乏，但其发生机制目前尚不清楚，我们推测VDBP表达水平的改变或许与维生素D缺乏有关。此外，VDBP可转化为一种强效巨噬细胞活化因子，在炎症反应中激活巨噬细胞，并增强C5a对巨噬细胞、中性粒细胞等免疫活性细胞的趋化作用[19]。PCOS被认为是一种慢性低度炎症性疾病，研究发现PCOS患者的卵巢组织中淋巴细胞和巨噬细胞的数目明显增加，炎症信号通路异常激活，导致排卵障碍[20]。颗粒细胞VDBP的异常表达或许参与了PCOS卵巢局部的炎症反应。

我们发现亮氨酸拉链肿瘤抑制因子1(LZTS1)在PCOS患者中的表达水平明显降低。LZTS1调节细胞分裂M期细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cdk1)的活性，LZTS1的缺失可导致有丝分裂时间缩短，染色体分离发生错误[21]。因此LZTS1可影响细胞增殖和肿瘤生长，在多种人类肿瘤中都发现了LZTS1的表达下调[22]。Miura等[23]将胎鼠卵巢移植到雄性宿主体内，发现LZTS1的表达在移植后7～10 d 降低，而一些睾丸相关基因表达增加，进一步研究发现是由雄性宿主的睾酮所介导。因此我们推断LZTS1的表达下调或许与PCOS高雄激素血症有关，进而影响颗粒细胞的增殖导致PCOS卵泡发育异常。

在这项研究中，我们分析了PCOS患者颗粒细胞的蛋白质表达谱，共鉴定出329个差异表达蛋白。差异蛋白参与葡萄糖、脂质及氨基酸代谢等多种生物学通路，我们发现其中一些差异蛋白可能涉及颗粒细胞凋亡、活性氧代谢和卵巢炎症反应等过程。未来进一步探索这些差异蛋白的功能或许可为PCOS发病机制的研究提供更多线索。