玉带凤蝶成虫对柑橘枝叶挥发物的嗅觉和行为反应

罗宇婕, 汪 洋, 周 琼, 何 杰, 李 幸

(湖南师范大学生命科学学院, 长沙 410081)

植物不仅可以为昆虫提供食物,还为其提供繁衍场所,对昆虫生存有着重要意义(Olssonetal., 2005)。植物的挥发性有机物质可以调节植物和昆虫之间的关系(de Moraesetal., 2001),有助于昆虫寻找食物以及产卵场所(Byersetal., 1985; Showler, 2001)。触角是昆虫的重要嗅觉器官,而嗅觉是昆虫感受外界刺激并产生选择食物、求偶、交配及产卵等各种行为的基础之一,对其种群生存和繁衍有重要作用(Ngumbietal., 2009; Zhangetal., 2015; Gadenneetal., 2016)。植食性昆虫可以通过灵敏的嗅觉系统,感受寄主植物产生的化学信息,并产生趋向寄主植物的行为反应(杜永均和严福顺, 1994)。昆虫产卵前先定位寄主植物及其栖息地的位置,再选择合适的寄主植物产卵,寄主植物挥发物在昆虫寻找产卵场所的过程中起重要作用(Renwick, 1989; Hanks, 1999; 张文璐等, 2018)。因此,研究寄主植物挥发物对昆虫触角电位(electroantennogram, EAG)、以及趋向行为和产卵选择行为的影响,对害虫的防治和益虫的利用具有重要指导意义。

玉带凤蝶Papiliopolytes隶属于凤蝶科(Papilionidae)凤蝶属Papilio,寡食性,幼虫主要以芸香科(Rutaceae)柑橘属Citrus植物叶片为食,是柑橘类果树的重要害虫。玉带凤蝶成虫产卵于柑橘嫩叶及嫩梢端部,孵化的幼虫取食叶片为害,危害严重时仅留枝干(吴平辉等, 2006; 尹小刚等, 2015)。该虫在我国的两河流域至台湾、海南等19个省份均有分布,长江以北地区一般为每年发生3～4代,年平均温度较高地区每年则可发生5～6代,均以蛹越冬(叶黎红等, 2008),国外分布于印度、日本、马来西亚半岛和美国等(Clarke and Sheppard, 1972; Suwarnoetal., 2010; Hondaetal., 2012),成虫寿命1个月左右(尹小刚等, 2015)。

已有研究报道了玉带凤蝶的生物学和形态学(Islam, 2019)、雌雄成虫触角感器类型和分布(汪洋等, 2019)、配偶选择(Westermanetal., 2019)、不同寄主植物对玉带凤蝶取食、生长和繁殖的影响(Shobanaetal., 2010)、玉带凤蝶成虫挥发物(mura and Honda, 2005)以及雄性玉带凤蝶利用表皮碳氢化合物来识别异性(muraetal., 2020)等,而寄主植物挥发物对该虫行为的影响报道甚少。廖宇(2009)发现,玉带凤蝶羽化当天即可交尾,交尾翌日开始产卵; Suwarno(2010)研究了玉带凤蝶对4种寄主植物的产卵选择,发现在柑橘Citrusreticulata上产卵最多,且其更喜欢在叶片上产卵而不是茎上;李明涛等(2020)研究玉带凤蝶视觉及嗅觉识别行为表明,访花及求偶过程中的颜色与气味对其都有一定的诱集作用。

本研究通过动态顶空吸附法收集柑橘枝叶挥发物,使用气质联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)及气相色谱-触角电位联用系统(coupled gas chromatography-electroantennogram detection, GC-EAD)鉴定柑橘枝叶挥发物中对玉带凤蝶成虫触角有电生理活性的化学成分,并进一步分析了这些化合物对该虫嗅觉行为和产卵选择行为的影响,以期为揭示玉带凤蝶产卵选择的行为机制,以及该虫的防治和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试昆虫: 玉带凤蝶成虫:2019年5-10月在四川宜宾以红心蜜柚Citrusmaxima(Burm) Merr. cv Hongxinmiyou叶饲喂幼虫至化蛹,将蛹带回湖南师范大学昆虫行为与化学生态学实验室。待成虫羽化后按性别、日龄(羽化后1个光周期视为1日龄, 其余日龄依次类推)分别置于养虫笼(30 cm×30 cm×30 cm)内, 实验室内温度(27±2) ℃,相对湿度(75±5)%,提供10%蜂蜜水饲喂。选取展翅正常、健康的雌、雄成虫供试。

1.1.2供试植物:赣南早脐橙Citrussinensiscv. Navel树苗购于宿迁韵岚花卉有限公司,将树苗栽种于花盆(高35 cm,口径32.5 cm)中,定期施肥管理,取枝叶生长发育正常的植株供试。

1.2 柑橘叶片挥发物的收集与分离鉴定

参考张萌萌等(2020)的动态顶空吸附法收集柑橘枝叶的挥发物。将一个透明、无味烤肉袋(Toppits,Minden,德国)套在上述供试的赣南早脐橙树苗上。挥发物提取装置的连接由左向右依次为大气采样仪(北京市劳动保护科学研究所)、活性炭瓶(内有活性炭)、气味源、吸附管(内有吸附剂 Porapak Q 50 mg)、流量计(上海函格生物科学有限公司)、大气采样仪,并均由PVC管连接,大气采样仪流速设定为500 mL/min(图1)。为保证气密性,各接口处均用封口膜密封。采集前对提取系统进行1 h预处理(9:00-10:00,不接吸附剂,只是让气体充满整个装置)。挥发物采集时间为6 h(10:00-16:00)。采集完毕立即用色谱纯正己烷(TEDIA,美国)洗脱吸附管内的挥发物,获得0.5 mL洗脱液后立即置于-20 ℃冰箱中保存。依照上述实验步骤,取3棵生长状况同步的柑橘植株作为重复,同步收集和洗脱空袋的挥发物作为对照。

图1 柑橘枝叶挥发物的提取装置Fig. 1 Extraction device for volatiles from the branches and leaves of citrus研究所用柑橘品种为赣南早脐橙Citrus sinensis cv. Navel。The citrus variety used in this study was Citrus sinensis cv. Navel. 下同。The same below. 图中箭头为气流方向。The arrow in the figure represents the direction of air flow.

GS-MS(7890A-5975C,Agilent Technology,美国)分析收集的柑橘枝叶挥发物洗脱液成分条件:样品进样量为1 μL,色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。进样口温度为250 ℃,无分流进样,检测器为氢气火焰检测器,载气为99.999%高纯度氦气, 柱气流量为1.0 mL/min, 柱温升温程序为:起始温度50 ℃, 保持3 min, 以10 ℃/min升至250 ℃,保持1 min。再以30 ℃/min升至300 ℃,保持5 min。质谱电离方式为EI,电离能量为70 eV,扫描质量范围是50～650 amu。通过核对谱库(NIST17)的质谱图对挥发物的各组分进行化学成分鉴定。

1.3 GC-EAD鉴定柑橘挥发物中对玉带凤蝶具有电生理活性的物质

将玉带凤蝶触角用干净的眼科剪从基部取下,端部剪去约1 mm,再将触角两端分别搭在蘸有导电胶的银电极两探头上。取柑橘苗挥发物洗脱液样品注入气相色谱仪的进样口,出口端的气体经过分流器以1∶1的比例,一半进入检测装置,另一半混合洁净空气流向昆虫触角。触角感受到气相色谱分离的物质气流,产生的信号经过刺激放大器后通过直流交流放大器,最后通过计算机的GC-EAD(7890B-Syntech)软件记录。GC分析条件设置与1.2节的GC-MS同。

每次取2 μL洗脱液样品进行GC-EAD测试。本研究共测试1-5日龄玉带凤蝶雌成虫9头、雄成虫5头。其中能引起3头以上玉带凤蝶产生明显EAG反应的化合物,视为活性化合物。进一步通过GC-MS分析鉴定这些活性化合物的种类。

1.4 供试化合物的选择

选取1.2和1.3节引起玉带凤蝶成虫EAG反应最强烈且反应频次最高的柑橘枝叶挥发物中的3种活性化合物[叶醇、芳樟醇、(+) -柠檬烯],同时参考Liu和Zhou(2016)及刘路(2014)对芸香科柑橘属Citrus植物挥发性成分的分析,选取其中9种化合物[柠檬醛、愈创木酚、糠醇、壬醛、(-) -柠檬烯、丁酸丁酯、1-壬醇、L-香芹酮和R-香芹酮],共12种化合物供试,进行玉带凤蝶成虫的EAG和行为学测试。这些化合物在先前的研究中被发现对柑橘大实蝇Bactroceraminax有引诱或驱避作用(刘路等, 2014; Liu and Zhou, 2016; 李可, 2020),或对柑橘木虱Diaphorinacitri有显著引诱作用(林妗蓓等, 2020)。上述12种挥发性化合物标准品信息见表1。

表1 供试挥发性化合物标准品及其溶剂Table 1 Tested standard compounds of volatile compounds and their solvents

1.5 玉带凤蝶对柑橘枝叶挥发性化合物的EAG反应测试

将柑橘枝叶挥发性化合物标准品用正己烷配制成0.001, 0.01, 0.1, 1, 10和100 μg/μL 6个浓度梯度,设正己烷为对照。测试前,先将玉带凤蝶成虫放置于通风无刺激气味处静置1 h,触角剪取和连接方法同1.3节的GC-EAD操作。将滤纸条(4 cm×0.5 cm)置入巴斯德管内,管末端连接气体刺激控制装置,刺激气体流量为200 mL/min,刺激时间为500 ms。取10 μL待测样品滴在巴斯德管内的滤纸上,对照为等体积的正己烷。连续空气流量为600 mL/min,经活性炭过滤,并通过蒸馏水,提供给测试触角。所有样品均测试1日龄和5日龄雌、雄成虫各5头。测试时,先用正己烷刺激触角1次,然后依次测试各样品,每两次刺激间隔1 min,最后再用正己烷刺激1次。用Syntech EAD Pro软件记录反应值,每条触角重复2次,取平均值作为测试值。EAG反应相对值(mV)=所测气味刺激的EAG反应值(mV)-测试前后对照刺激的EAG反应平均值(mV)。

1.6 T型管嗅觉行为测试

自制的T型嗅觉仪参照周琼等(2011)的Y型嗅觉仪改进,以适用于玉带凤蝶的行为学测试。T型管的内径为10 cm,导入管长10 cm,两臂分别长40 cm,空气在经过大气采样仪(QC-1S型,北京市劳动保护科学研究所)后,依次通过活性炭、蒸馏水和流量计,调节空气流量为600 mL/min。

将分别滴有10 μL浓度为10 μg/μL的供试化合物和等量正己烷(对照)的滤纸片置于T型嗅觉仪两臂端的玻璃管中。测试选择在晴天自然光照条件下,在室内于9:00-17:00进行,调整T型管的位置,以保证自然光对两臂照射的光线一致。室内温度(27±2) ℃。将玉带凤蝶从T型嗅觉仪的导入管引入,每次放入1头成虫,观察并记录其选择行为。当玉带凤蝶成虫经过T型管的交叉区域,在某一臂内停留30 s以上则视为选择;若成虫在导入管内5 min没有做出选择,则视为无反应。每测试1头虫后,用吹风机对T型管进行空吹5 min以除去可能残留的挥发物。每测试5头虫更换新的带试剂滤纸条,同时将处理和对照双臂互换位置,以减少气味源和方位对玉带凤蝶选择可能产生的影响。每个性别的虫测试完1种物质后,彻底清洗嗅觉仪,晾干后使用。各样品均测试5-6日龄成虫30头,雌雄比为1∶1。嗅觉行为选择率(%)= [(选择实验组或对照组虫数)/(选择实验组虫数+选择对照组虫数)]×100。

1.7 玉带凤蝶成虫产卵选择行为测试

模拟柑橘叶片形状,将绿色卡纸剪成面积约20 cm2(长7 cm、宽4 cm)的椭圆形。将经EAG和嗅觉行为实验筛选出来的4种待测物质(包括芳樟醇、叶醇、壬醛和柠檬醛)用石蜡油配制成浓度为10 μg/μL的待测物质,取4种待测物质各30 μL,均匀滴加在绿色卡纸上,以滴加石蜡油的绿色卡纸为对照。将上述4种处理及对照的卡纸用细铁丝将其水平固定、间隔均匀地摆放在测试笼(50 cm×50 cm×50 cm)内,卡纸离笼底约10 cm高。将盛装红色布料蘸浸10%蜂蜜水的培养皿放置在笼中提供食物营养。选择在晴天进行测试,室内温度(29±1) ℃,相对湿度为60%±5%,自然光,同时用50 W的LED灯做补偿光源以保证测试虫笼的光照均匀。每笼引入5对5-15日龄(预实验发现5日龄后产卵较多)雌、雄成虫,设置4个重复。测试时间为9:00-17:00,每天统计各卡纸上的落卵量,同时更换各处理和对照卡纸。

1.8 数据分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行差异显著性分析,玉带凤蝶成虫对各测试物质的EAG反应值在同性别不同日龄和同日龄不同性别之间用T检验进行分析。EAG反应结果用Origin软件处理数据,并绘制成平滑曲线。T型管选择行为实验数据用卡方(χ2)检验,不同测试物质对玉带凤蝶产卵选择实验数据用单因素方差分析(one-way ANOVA)最小显著差异法(least significant difference, LSD)进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 柑橘枝叶挥发物中对玉带凤蝶成虫触角具有电生理活性的化合物筛选

采用动态顶空吸附法对赣南早脐橙枝叶挥发物进行采集和GC-MS分析,发现其成分共有30种,分别为烯烃类(13种)、烷烃类(8种)、醇类(4种)、酯类(3种)、醛类(1种)和吡嗪类(1种)。GC-EAD测试结果显示,赣南早脐橙枝叶挥发物中有12种成分可多次引起玉带凤蝶的EAG反应(图2),包括叶醇、α-蒎烯、桧烯、月桂烯、顺-3-己烯基乙酸酯、(+)-柠檬烯、3-蒈烯、芳樟醇、α-松油醇、β-石竹烯、γ-葎草烯和正十六烷,其中能引起玉带凤蝶雌成虫触角反应最强烈且反应频次最高有3种化合物,包括芳樟醇、(+)-柠檬烯和叶醇,9头雌成虫的EAG反应频次为88.89%～100%;同时,5头雄成虫对芳樟醇的EAG反应频次也高达100%(表2)。

图2 GC-EAD鉴定柑橘枝叶挥发物中对玉带凤蝶雌雄成虫触角具有电生理活性的化合物Fig. 2 Electrophysiologically active compounds in volatiles from the branches and leaves of citrus tothe antennae of female and male adults of Papilio polytes identified by GC-EAD1: 叶醇Leaf alcohol; 2: α-蒎烯α-Pinene; 3: 桧烯Sabinene; 4: 月桂烯Myrcene; 5: 顺-3-己烯基乙酸酯cis-3-Hexenyl acetate; 6: (+)-柠檬烯(+)-Limonene; 7: 3-蒈烯3-Carene; 8: 芳樟醇Linalool; 9: α-松油醇α-Terpineol; 10: β-石竹烯β-Caryophyllene; 11: γ-葎草烯γ-Humulene; 12: 正十六烷Hexadecane; EAD: 触角电位反应信号Electroantennagram trace; FID: 气相色谱信号Gas chromatography trace; GC-EAD: 气相色谱-触角电位联用系统Coupled gas chromatography-electroantennogram detection.

2.2 玉带凤蝶对柑橘枝叶挥发性化合物的EAG反应

玉带凤蝶对不同剂量柑橘枝叶挥发性化合物标准品的EAG反应结果见图3。从图3可以看出,测试剂量在0.01～1 000 μg的范围内,1日龄雌成虫触角对所测试的12种挥发性化合物标准品大多表现出剂量依赖的EAG反应,尤其是对叶醇、壬醛、芳樟醇、柠檬醛和愈创木酚反应强烈:在测试剂量为100 μg时,1日龄雌成虫对上述5种挥发性化合物的EAG反应值排序为:芳樟醇(0.45 mV)>柠檬醛(0.35 mV)>壬醛(0.31 mV)>愈创木酚(0.30 mV)>叶醇(0.29 mV)(图3: A-E);在测试剂量1 000 μg时,1日龄雌成虫对叶醇、壬醛和愈创木酚的EAG反应值最大,分别高达0.73, 0.54和0.38 mV,且还处于上升期;而对芳樟醇、柠檬醛、1-壬醇和丁酸丁酯的EAG反应值则分别为0.47, 0.38, 0.21和0.20 mV,已近于拐点或开始下调(图3: B, C, F, G);雌成虫对各浓度的(+)-柠檬烯、(-)-柠檬烯和糠醇的EAG反应较弱,最大反应值均低于0.10 mV(图3: H-J)。另外,1日龄雌成虫对所测试挥发性化合物的EAG反应值均高于5日龄雌成虫,但差异不显著(P>0.05)(图3: A-L)。

图3 玉带凤蝶成虫对柑橘枝叶挥发性化合物的触角电位反应(EAG)Fig. 3 Electroantennogram (EAG) responses of Papilio polytes adults to the volatile compoundsfrom the branches and leaves of citrusA: 叶醇Leaf alcohol; B: 芳樟醇Linalool; C: 柠檬醛Citral; D:壬醛Nonanal; E: 愈创木酚Guaiacol; F: 丁酸丁酯n-Butyl butyrate; G: 1-壬醇1-Nonanol; H:(+) -柠檬烯 (+)-Limonene; I: (-) -柠檬烯(-)-Limonene; J: 糠醇 Furfuryl alcohol; K: L-香芹酮L-Carvone; L: R-香芹酮 R-Carvone. 供试化合物信息同表1。下同。For the information of the tested compounds, see Table 1. The same below.

雄成虫对所测试化合物的EAG反应明显弱于雌成虫,最高反应值均低于0.20 mV。其中,1日龄雄成虫对芳樟醇、柠檬醛、叶醇和壬醛的EAG反应值,在测试剂量为1 000 μg时最大,仅为0.20～0.10 mV左右,而5日龄雄成虫对芳樟醇、柠檬醛、叶醇和壬醛的EAG反应值均低于0.10 mV(图3: A-D); 1日龄雄成虫对L-香芹酮和R-香芹酮的EAG反应值在1 μg达到最大,5日龄雄成虫对愈创木酚、糠醇、(+)-柠檬烯和(-)-柠檬烯的EAG反应值在10 μg时达到最大,也均低于0.10 mV(图3: E, H-L);雄成虫对1-壬醇的EAG反应弱或无反应(图3: G)。同时,1日龄雄成虫对各气味化合物质的EAG反应值均高于5日龄雄成虫的,但差异不显著(P>0.05)(图3: A-L)。

综上,玉带凤蝶雌、雄成虫均对所测试的化合物产生不同程度的EAG反应。其中,雌成虫对测试化合物的EAG反应值显著高于相应日龄的雄成虫的(P<0.05);同时,1日龄雌、雄成虫反应值分别高于5日龄的雌、雄成虫(P>0.05)。不同日龄和性别的玉带凤蝶对测试化合物的EAG反应值的顺序为:1日龄雌成虫>5日龄雌成虫>1日龄雄成虫>5日龄雄成虫。

2.3 玉带凤蝶成虫对柑橘枝叶挥发性化合物的嗅觉行为

采用T型嗅觉仪,选取在上述EAG实验中引起玉带凤蝶成虫产生较高EAG反应的柑橘枝叶5种挥发性化合物标准品(叶醇、芳樟醇、柠檬醛、壬醛和愈创木酚),以及反应值低的柠檬烯的两种同分异构体(+)-柠檬烯、(-)-柠檬烯,测试对5-6日龄玉带凤蝶嗅觉行为选择的影响,结果见图4。从图4可以看出,测试剂量为100 μg时,雌成虫对芳樟醇选择率显著高于对照组(P<0.05),而对壬醛、柠檬醛、叶醇、(+)-柠檬烯和(-)-柠檬烯的选择率与对照组差异不显著(P>0.05),对愈创木酚的选择率显著低于对照组(P<0.05);雄成虫对芳樟醇、愈创木酚和柠檬醛的选择率显著高于对照组(P<0.05),而壬醛、叶醇、(+)-柠檬烯和(-)-柠檬烯对雄成虫的引诱或驱避作用均不显著(P>0.05)。

图4 玉带凤蝶成虫对柑橘枝叶挥发性化合物的嗅觉行为反应Fig. 4 Olfactory behavior responses of Papilio polytes adults to the volatile compounds from the branches and leaves of citrus测试剂量为100 μg;星号和NS分别表示实验组和对照组间差异显著(P<0.05)和不显著(P>0.05)(卡方检验)。The test dose was 100 μg. The asterisk and NS indicate significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, between the experimental group and the control group (χ2 test).

2.4 柑橘枝叶挥发性化合物对玉带凤蝶产卵选择的影响

选取在T型嗅觉行为测试中对玉带凤蝶雌成虫有明显和一定程度引诱作用的柑橘枝叶4种挥发性化合物标准品(芳樟醇、叶醇、壬醛和柠檬醛),研究它们对玉带凤蝶产卵选择行为的影响,结果见图5。从图5中可以看出,玉带凤蝶表现出对柑橘枝叶不同挥发性化合物具有明显产卵选择偏好,测试剂量为300 μg时,在滴有叶醇和芳樟醇的测试卡纸上的平均落卵量显著高于滴有壬醛、柠檬醛及石蜡油(对照组)的测试卡纸上的(P<0.05);同时,滴有壬醛和柠檬醛测试卡纸上的平均落卵量也多于对照组的,但差异不显著(P>0.05)。

图5 柑橘枝叶挥发性化合物对玉带凤蝶雌成虫产卵选择的影响Fig. 5 Effects of volatile compounds from the branches and leaves of citrus on the oviposition preference of female adults of Papilio polytes测试剂量为300 μg; 以石蜡油作为对照; 图中数据为平均值±标准误; 柱上不同小写字母表示差异显著(P <0.05, LSD检验)。The test dose was 300 μg. Paraffin oil was used as the control. Data in the figure are mean ±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference (P <0.05, LSD test).

3 讨论

芸香科柑橘属不同植物的挥发物随物种在化合物的组成和含量上有一定的差异,但有些特征性成分是共同的,从而形成对寡食性昆虫的引诱作用。Liu和Zhou (2016)、刘路等(2014)采用水蒸气蒸馏法从冰糖橙Citrussinensiscv. Bingtang、蜜桔Citrusreticulatacv. Satsuma、酸橙Citrusaurantium、南桔Citrusreticulata等鲜果皮中分离鉴定出芳樟醇、柠檬烯等多种共同成分;汤夏安等(2021)采用固相微萃取技术分析芸香科植物嫩梢的12种挥发性化合物,鉴定出含芳樟醇、D-柠檬烯等8种共同成分;李可(2020)对脐橙C.sinensis、红江橙Citrussinensis‘Hongjiangcheng’、温州蜜柑Citrusunshiu、尤力克柠檬Citruslimon‘Eureka’、香水柠檬Citruslimon‘Xiangshui lemon’的青果挥发物进行鉴定分析,也发现均含有芳樟醇、柠檬烯等。另外,同种植物的挥发物成分随地理环境、季节、生长时期和器官部位的不同,也存在组成和含量上的差异。Bai等(2016)研究表明季节变化和日变化都会影响亚热带竹林挥发性物质的释放;吴兰花(2019)鉴定分析发现南丰蜜桔Citrusreticulata春、夏、秋、冬四季嫩梢挥发性物质的种类和含量存在很大差异。枣树Zizyphusjujuba在幼叶期、花期和幼果期的挥发物成分有明显不同,其中幼果期的挥发物种类远远多于幼叶期,且每个发育期均有其特有挥发物(韩颖等, 2010)。本研究用于测试玉带凤蝶的12种挥发性化合物中,仅芳樟醇、柠檬烯、叶醇在赣南早脐橙枝叶的挥发物中检测到,其余9种化合物虽在本研究的柑橘苗中未检测到,但在柑橘属其他的寄主植物挥发物中有报道(万珊等, 2010; 刘路等, 2014; Liu and Zhou, 2016; 李可, 2020),说明柑橘属寄主植物挥发物的种类和含量随物种、地理环境、生长时期、环境因子(温度、阳光等)、受害状态等发生变化,但某些特征性成分是共同的,如均含有芳樟醇。玉带凤蝶主要以芸香科柑橘属的植物为食,根据以往报道的芸香科植物的挥发性成分以及本研究的结果,提示芳樟醇在玉带凤蝶的寄主定位和产卵选择中起重要作用。

EAG技术是一种在昆虫学研究中广泛应用的电生理方法,它可以直接检测昆虫对挥发性物质的化学信号反应(田厚军等, 2011),利用EAG反应分析引起昆虫电生理反应的植物挥发性化合物,可以为初步筛选引诱或驱避物质提供基础(Bhowmiketal., 2016; 钱明惠等, 2018)。玉带凤蝶对柑橘枝叶12种挥发性化合物的EAG反应结果发现,在测试剂量为0.01～1 000 μg时,叶醇、芳樟醇、柠檬醛、壬醛和愈创木酚均能引起玉带凤蝶雌、雄成虫产生不同程度剂量依赖的EAG反应(图3)。在测试剂量最大(1 000 μg)时,该虫对一部分挥发性化合物的EAG反应值已达到拐点,如芳樟醇、柠檬醛等;对另一部分挥发性化合物的反应仍处于上升阶段,如叶醇、壬醛、愈创木酚等;还对一部分物质的反应已下降,如香芹酮(图3)。说明玉带凤蝶对寄主挥发物不同成分的嗅觉敏感性有差异,其他植食性昆虫也有类似的结果。如华北大黑鳃金龟Holotrichiaoblita对桃树Amygdaluspersica挥发物的EAG反应相对值在不同的剂量有显著差异,当剂量为0.01和0.1 μg时,雄成虫对水杨酸甲酯的EAG反应值显著大于对Z-β-罗勒烯,而在剂量为1和10 μg时,该虫对各寄主植物挥发物的EAG反应值均无显著差异(张诺等, 2021)。同样苹褐带卷蛾Pandemisheparana成虫对不同类型寄主植物挥发性化合物的EAG反应活性存在差异,如雄成虫对醛类、腈类挥发物的平均EAG反应相对值整体较高(分别为0.726和0.715 mV),而对萜烯类挥发性化合物的EAG反应相对值较低(0.178 mV)(李广伟等, 2022)。

不同性别昆虫对寄主植物气味的嗅觉敏感性也存在差异。本研究的嗅觉行为选择实验发现,在测试剂量为100 μg时,仅有芳樟醇对玉带凤蝶雌、雄成虫有显著的引诱作用(图4),与在该剂量玉带凤蝶对芳樟醇的EAG反应最高这一结果(图3)一致;而该剂量的叶醇和壬醛虽能引起雌成虫较强的EAG反应,雌成虫并未表现出明显的EAG反应(图3);同时,该剂量的柠檬醛仅显著吸引雄成虫,愈创木酚显著驱避雌成虫而显著吸引雄成虫(图4)。相同日龄的玉带凤蝶雌成虫对柑橘枝叶挥发性化合物的EAG反应值明显高于雄成虫,说明其雌成虫对柑橘枝叶挥发物感知的敏感性高于雄成虫,但能引起行为反应的阈值比雄成虫高,提示玉带凤蝶雌、雄成虫对不同化合物的行为反应阈值有差异(图4),该结果与王延来等(2020)报道的昆虫对植物挥发物的EAG反应与行为反应率并非总是呈正相关类似;灰茶尺蠖Ectropisgrisescens雌、雄虫对非寄主植物土荆芥Chenopodiumambrosioides、留兰香Menthaspicata和黄花蒿Artemisiaannua的精油表现出随浓度而变化的EAG反应,但仅留兰香精油对灰茶尺蠖有显著的驱避作用,土荆芥和黄花蒿精油的定向作用不明显(张方梅等, 2018)。樟青凤蝶Graphiumsarpedon雌成虫比雄成虫对寄主植物顶空挥发物表现出更强的EAG反应(Lietal., 2010),香蕉象甲Cosmopolitessordidus(Budenbergetal., 1993)、枣飞象Scythropusyasumatsui(阎雄飞等, 2020)、甘薯蚁象Cylasformicarius(贾小俭等, 2017)、绿豆象Callosobruchuschinensis(王宏民等, 2017)等植食性昆虫中都得到类似的结果。上述结果提示,植食性昆虫对寄主植物不同的挥发性化合物,其EAG反应和行为反应各自存在一定的阈值和最佳剂量范围。当然,玉带凤蝶成虫的行为反应可能还受测试时的温湿度、光照、日龄、昆虫的生理状况和性成熟程度等因素影响,与其他昆虫(Weeetal., 2010; Wangetal., 2015)类似。大多数昆虫的雌虫比雄虫对寄主气味更敏感,与其在寻找寄主和繁殖等行为中所采取的策略不同有关,雌虫需要定位合适的寄主以产卵繁衍后代(赵凤霞, 1995; 张萌萌等, 2020)。

不同日龄或不同性成熟程度的成虫对气味的敏感性也有差异。豆野螟Marucavitrata的雌蛾求偶行为、主要性信息素组分和雄性反应均具有日龄相关性(Wangetal., 2015)。杜迎刚等(2015)发现,橘小实蝇Bactroceradorsalis雌、雄成虫从1日龄开始就对甲基丁香酚产生较强的 EAG 反应,但4日龄成虫的EAG反应值较低,而4日龄成虫是橘小实蝇性器官发育的关键日龄,他们认为橘小实蝇对甲基丁香酚的感受代谢机理比较复杂。van Loon等(1992)研究了欧洲粉蝶Pierisbrassicae和菜粉蝶P.rapae对寄主植物挥发物的EAG反应,发现这两种蝴蝶对标准化合物的刺激反应均随着日龄而变化。本研究中,1日龄的玉带凤蝶雌、雄成虫对柑橘枝叶挥发性化合物的EAG反应值均比5日龄的高(图3),说明1日龄成虫对柑橘枝叶挥发物更敏感,推测其生物学意义可能与玉带凤蝶羽化时即已性成熟开始求偶交尾有关,这时玉带凤蝶需要通过寄主植物挥发物定位寄主和配偶,与已报道的寄主植物挥发物可以刺激苹果蠹蛾Cydiapomonella雌蛾释放信息素、求偶和产卵(Yanetal., 1999)、天牛的雌雄两性均各自被寄主植物挥发物吸引到寄主上后,再进行性信息素的通讯联系(Ginzel and Hanks, 2005)类似;同时,玉带凤蝶雌虫对植物气味物质敏感,还与其定位合适的寄主植物产卵有关。而玉带凤蝶5日龄成虫的EAG反应值低(图3),可能与其因为暴露在外界环境的时间长,接触包括寄主植物挥发物在内的外界环境各种干扰气味较多而产生一定程度的感觉适应有关,这与李可(2020)研究不同日龄和性别的柑橘大实蝇Bactroceraminax成虫对寄主植物挥发物N-(3-甲基丁基)乙酰胺 [N-(3-methyl-butyl) acetamide] 的EAG 反应时,3日龄雌、雄成虫较之于15日龄雌、雄成虫的EAG反应值高的情况类似。

许多凤蝶的产卵刺激系统需要多种因素的协同作用(Honda, 1990; Ohsugietal., 1991),评估潜在的合适宿主主要是通过用前足敲打树叶表面来实现的,在此过程中,植物化学物质被跗节的化学和触觉感受器感知(Roessinghetal., 1991),尽管寄主植物的非挥发性成分在凤蝶的产卵活动中起重要作用(Nakayamaetal., 2003),但来自寄主植物的嗅觉线索可以通过影响凤蝶的寄主定位,从而刺激雌性产卵(Bauretal., 1993; Baur and Feeny, 1994; Heinz, 2008; Tangetal., 2013)。我们的研究结果支持上述观点,作为寄主柑橘枝叶挥发物的成分芳樟醇,对玉带凤蝶有明显的引诱和产卵引诱作用,但仅靠这单一的挥发性化合物引诱过来的玉带凤蝶在模拟柑橘叶片的纸片上的日均落卵量仅为3.75粒/卡纸(图5),提示玉带凤蝶的产卵选择及其落卵量除了受寄主植物挥发物的引诱作用的影响外,可能也与产卵基质表面的物理性质和非挥发性的化学性质有关(Roessinghetal., 1991; Nakayamaetal., 2003)、周围环境(比如光照、温度、湿度、风力)、幼虫营养、成虫的营养补充、玉带凤蝶雌虫自身的生理状态等因素密切相关。另据报道,芳樟醇还是玉带凤蝶两性成虫的挥发物成分,且在雄性体内芳樟醇含量更高(mura and Honda, 2005),结合本研究芳樟醇可引起玉带凤蝶雌、雄成虫显著的EAG反应以及均有明显引诱作用的结果(图3, 4),提示芳樟醇在玉带凤蝶的寄主识别定位以及两性活动中起重要作用,同时,也是玉带凤蝶的产卵刺激剂。

已有研究表明,柑橘挥发物中的芳樟醇、柠檬醛、壬醛、柠檬烯和丁酸丁酯对柑橘大实蝇雌成虫有明显的引诱作用,愈创木酚、糠醇对柑橘大实蝇雌成虫有显著驱避作用(Liu and Zhou, 2016; 李可, 2020)。L-香芹酮对柑橘木虱有显著引诱作用(林妗蓓等, 2020)。本研究结果显示,这些化合物仅芳樟醇对玉带凤蝶雌成虫有明显引诱作用,愈创木酚对玉带凤蝶雌成虫有明显驱避作用;其余对柑橘大实蝇或柑橘木虱有引诱作用的寄主挥发物包括柠檬烯、柠檬醛、壬醛、L-香芹酮等并未对玉带凤蝶成虫行为有明显影响(图4),说明以相同寄主为食的不同植食性昆虫,引起它们行为反应的寄主植物挥发物有差异,这可能在植食性昆虫与植物长期的协同进化以及植食性昆虫的生态位竞争中具有重要意义,是值得进一步探讨的问题。

致谢承蒙湖南省农业科学研究院植物保护研究所陈昂博士为本研究提供GC-MS分析帮助,长沙市望城区光明蝴蝶文化主题公园毛舟农艺师提供虫源支持,在此一并表示衷心感谢!