乳酸脱氢酶抑制剂减轻内毒素诱导的小鼠急性肝损伤

昝欣言，杨梦欣，张馨月，杨永强，张 力

(重庆医科大学1.基础医学院病理生理学教研室、2.干细胞与组织工程研究室，重庆 400000)

由病原体感染、药物中毒、毒素暴露等原因导致的急性肝损伤是临床常见疾病，严重者可危及患者生命[1]。失控性的炎症反应和氧化应激所导致的肝细胞损伤被认为是急性肝损伤发生发展的关键机制[2]。代谢反应为细胞的正常生理活动提供必须的能量和化学支持，也是病理反应中不可缺少的代谢基础[3]。因而，调控代谢反应已成为急性肝损伤等多种疾病防治的新途径。

葡萄糖代谢是细胞中最重要的代谢反应之一，包括糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等代谢环节[4]。炎症、肿瘤等常见病理过程中常伴随糖酵解反应的增强，这一代谢重编程现象称为瓦伯格效应，与炎症损伤、肿瘤增殖等关系极其密切[5]，而抑制糖酵解可明显减轻炎症反应、抑制肿瘤增殖[6]。

内毒素，或称脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性细菌的胞壁成分，是最常见的致炎刺激之一，与多种临床肝损伤的发生发展关系密切[7]。LPS可在D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal)致敏的小鼠中选择性诱导肝细胞凋亡，被广泛应用于实验研究[8]。我们前期研究发现，采用2-脱氧葡萄糖抑制糖酵解可明显减轻LPS/D-Gal诱导的小鼠急性肝损伤[9]。乳酸脱氢酶催化丙酮酸转换为乳酸，是糖酵解最后一步反应的关键酶[10]，本研究探讨了乳酸脱氢酶抑制剂在急性肝损伤中的潜在保护效应。

1 材料

1.1 实验动物SPF级BALB/c雄鼠，6～8周龄,(20±2) g，由重庆医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养环境为相对湿度50%±5%,室温(22～25) ℃，12 h 光照/ 黑夜循环。

1.2 试剂脂多糖、D-半乳糖胺(美国Sigma公司)，NHI-2(美国Cayman公司)，丙氨酸转氨酶测试盒、冬氨酸转氨酶测试盒、丙二醛测定试剂盒、乳酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，caspase-3、caspase-8、caspase-9比色测定试剂盒(江苏碧云天生物工程研究所)，BCA蛋白试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)，TNF-α检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)，原位细胞死亡检测试剂盒(美国Roche公司)。

2 方法

2.1 实验分组将104只小鼠随机分为4组(每组26只)：1)溶剂对照组；2)NHI-2对照组：乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2(30 mg·kg-1)腹腔注射；3)LPS/D-Gal组：腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)及D-Gal(700 mg·kg-1)诱导急性肝损伤；4)LPS/D-Gal+NHI-2组：NHI-2( 30 mg·kg-1)在LPS/D-Gal处理前30 min经腹腔注入。为探讨乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2对LPS/D-Gal诱导的TNF-α产生的影响，32只小鼠(每组8只)在LPS/D-Gal处理后1.5 h处死，收集血清用于检测TNF-α水平；为探讨乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2对LPS/D-Gal诱导的肝损伤的影响，32只小鼠(每组8只)在LPS/D-Gal处理后6 h处死，收集血清和肝组织样本用于相关检测；为探讨乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2对LPS/D-Gal处理小鼠生存率的影响，40只小鼠(每组10只)在经上述处理后，每6 h观察一次各组小鼠死亡情况并绘制生存曲线。

2.2 血清转氨酶检测各组小鼠在LPS/D-Gal处理6 h后处死并采集血清样本，静置15 min后离心取上清。使用转氨酶比色法检测试剂盒，将所得血清作为待测样本进行检测。按试剂盒步骤加样孵育后，使用酶标仪测得各样本OD值并带入标准曲线计算实际血清转氨酶水平。

2.3 血清乳酸检测各组小鼠在LPS/D-Gal处理6 h后处死并采集血清样本，使用血清乳酸比色法检测试剂盒，按试剂盒步骤加样并使用酶标仪检测各血清样本OD值，最终带入标准曲线计算得到实际血清乳酸含量。

2.4 血清炎症因子检测各组小鼠在LPS/D-Gal处理1.5 h后处死并采集血清样本，使用小鼠TNE-α ELISA试剂盒，按试剂盒说明书步骤加样孵育，并使用酶标仪检测各血清样本OD值，并带入标准曲线中计算得出血清中TNF-α含量实际值。

2.5 石蜡切片及HE染色肝组织置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定后自来水流动冲洗2 h，再进行脱水，透明，浸蜡，包埋制成石蜡切块。将石蜡切块进行切片，制成石蜡切片(4 μm)，脱蜡复水后，依次进行苏木精及伊红染色。镜下确定染色成功后，脱水，透明，封片，并于显微镜下拍摄观察。参照文献方法[11]，采用Suzuki评分对肝组织结构损伤程度进行半定量评估。(Tab 1)

Tab 1 Suzuki score

2.6 TUNEL染色石蜡切片经脱蜡复水后，依次进行TUNEL及苏木精染色，脱水透明封片后，在高倍镜下拍摄并观察，胞核呈现棕褐色的为TUNEL阳性凋亡细胞。

2.7 肝组织Caspase活性检测采用caspase活性试剂盒中的裂解液制备10%的肝组织匀浆，将新鲜的肝组织匀浆乙酰辅酶用于caspase-3/8/9检测。使用caspase-3/8/9活性试剂盒，按试剂盒说明书步骤加样及孵育，并用酶标仪检测各样本OD值，带入标准曲线计算后得到匀浆样本中caspase-3/8/9活性。再将剩余组织匀浆进行蛋白浓度检测，最终计算得到各个肝组织样本中caspase-3/8/9活性。

2.7 肝组织丙二醛检测用生理盐水进行10%肝组织匀浆制备。将所得生理盐水肝组织匀浆作为待测样本，按MDA检测试剂盒说明书步骤加样孵育，并用酶标仪检测OD值后计算出匀浆丙二醛含量。同时使用BCA蛋白试剂盒，检测匀浆蛋白浓度，最终计算出各样本肝组织MDA浓度。

3 结果

3.1 乳酸脱氢酶抑制剂降低血清乳酸含量如Fig 1所示，乳酸脱氢酶抑制NHI-2单独处理对正常小鼠血清乳酸水平无明显影响(P>0.05)；但LPS/D-Gal+NHI-2组小鼠血清乳酸水平明显低于LPS/D-Gal组(P<0.05)。

Fig 1 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on serum lactate level in LPS/D-Gal-insulted n=8)

3.2 乳酸脱氢酶抑制剂减轻LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤乳酸脱氢酶抑制NHI-2单独处理对小鼠血清ALT及AST水平均无明显影响(P>0.05)；但NHI-2干预可明显降低LPS/D-Gal处理小鼠血清中的ALT和AST水平(P<0.05)(Fig 2)。与此一致，NHI-2干预可明显减轻LPS/D-Gal诱导的肝组织淤血、肝小叶结构破坏及肝细胞变性坏死等组织形态学异常改变，LPS/D-Gal+NHI-2组肝组织损伤评分明显低于LPS/D-Gal组(P<0.01)(Fig 3)。这些结果说明，NHI-2在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中发挥了保护效应。

Fig 2 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on serum ALT and AST level in LPS/D-Gal-insulted n=8)

3.3 乳酸脱氢酶抑制剂提升实验动物存活率如Fig 4所示，LPS/D-Gal组小鼠死亡率达到80%，而采用乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2干预后，模型小鼠死亡率仅为10%，两组间小鼠生存率差异有显著性(P<0 .01)。进一步说明，NHI-2明显减轻了LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤。

3.4 乳酸脱氢酶抑制剂减轻LPS/D-Gal诱导的肝细胞凋亡大量肝细胞凋亡是LPS/D-Gal诱导急性肝损伤的重要特征[12]。如Fig 5所示，乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2干预也可明显抑制LPS/D-Gal诱导的肝组织内caspase-3(P<0.01)、caspase-8(P<0.05)和 caspase-9(P<0.01)的活化。TUNEL染色分析也发现，LPS/D-Gal+NHI-2组肝组织内TUNEL阳性凋亡细胞数明显少于LPS/D-Gal组(P<0.01)(Fig 6)。这些结果说明，NHI-2抑制了LPS/D-Gal诱导的肝细胞凋亡。

3.5 乳酸脱氢酶抑制剂未减轻LPS/D-Gal诱导炎症反应检测各组小鼠血清中TNF-α的水平，结果显示，乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2干预对正常小鼠及模型小鼠血清TNF-α水平均无明显影响(P>0.05)(Fig 7)。

Fig 3 Results of liver sections stained with H&E and Suzuki n=8)

3.6 乳酸脱氢酶抑制剂减轻LPS/D-Gal诱导的氧化应激脂质过氧化产物MDA是反应组织氧化应激的常用指标[14]。在本研究中，乳酸脱氢酶抑制剂NHI-2干预后，模型小鼠肝组织中MDA水平明显下降(P<0.05)。(Fig 8)

4 讨论

增强的糖酵解是炎症、肿瘤等多种病理过程的关键代谢基础和药物干预新靶点[6]。本研究中，我们发现，乳酸脱氢酶抑制剂干预可明显降低血中转氨酶水平、减轻肝组织病理学异常并提升实验小鼠存活率。这些结果提示：乳酸脱氢酶可能在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中发挥了重要的作用。

Fig 5 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on caspase-3/8/9 level of liver tissues in LPS/D-Gal-insulted n=8)

Fig 6 Results of liver sections stained with TUNEL and count of TUNEL-positive n=8)

Fig 7 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on level of serum TNF-alpha in LPS/D-Gal-insulted n=8)

Fig 8 Effect of lactate dehydrogenase inhibitor on MDA level of liver tissue in LPS/D-Gal-insulted n=8)

Fig 9 Reaction formula of lactate dehydrogenase catalyzing production of hydrogen peroxide

大量肝细胞凋亡是LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤的重要特征[12]。肝细胞凋亡依赖于caspase酶的级联激活[13]。本研究中，乳酸脱氢酶抑制剂可明显降低LPS/D-Gal暴露小鼠肝组织内caspase-8、caspase-9和caspase-3的活性。与此相一致，乳酸脱氢酶抑制剂干预也减少了LPS/D-Gal暴露小鼠肝组织内TUNEL阳性凋亡细胞数目，提示乳酸脱氢酶抑制剂可减轻LPS/D-Gal诱导的肝细胞凋亡，证实了乳酸脱氢酶抑制剂在急性肝损伤中的保护效应。

LPS/D-Gal诱导的促炎因子TNF-α是引起肝细胞凋亡的主要损伤因子，可与肝细胞膜上的I型TNF-α受体结合后启动死亡受体介导的凋亡途径[13]。前期研究发现，2-脱氧葡萄糖抑制糖酵解可明显下调LPS/D-Gal诱导的TNF-α产生[9]。然而，本研究中，乳酸脱氢酶抑制剂干预对LPS/D-Gal暴露小鼠TNF-α水平并无明显影响，说明糖酵解的不同反应环节在炎症反应中的作用可能并不相同。

氧化应激是LPS/D-Gal诱导肝细胞损伤的重要机制。有研究发现[15]采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸干预可抑制肝细胞凋亡、减轻肝组织损伤。前期发现，NADPH氧化酶抑制剂干预可减轻LPS/D-Gal暴露小鼠肝内氧化应激水平和肝组织损伤程度。本研究中，乳酸脱氢酶抑制剂干预也降低了肝组织中MDA的水平，说明乳酸脱氢酶可能参与急性肝损伤中的氧化应激。

有研究表明，乳酸脱氢酶可调控软骨细胞中活性氧的生成[16]。也有研究进一步发现，乳酸脱氢酶可在超氧阴离子的激发下，以NADH为电子受体，催化产生额外的过氧化氢。这一反应可循环进行，大幅增加细胞内自由基的水平、增强氧化应激[17]。与我们的结果相一致，敲低乳酸脱氢酶表达或抑制乳酸脱氢酶活性可降低Hela细胞中活性氧的水平。由此可见，乳酸脱氢酶抑制剂可通过调节细胞内的氧化-抗氧化平衡而在急性肝损伤中发挥保护效应。

综上所述，乳酸脱氢酶可能是急性肝损伤中的一个新的重要致病因子，其机制可能与乳酸脱氢酶增强肝组织内氧化应激有关。