高效液相色谱法测定追风透骨丸中α-香附酮和香附烯酮的含量

宋 瑩 崔业波 张大勇 马晓静 王路宏

追风透骨丸由制川乌、白芷、制草乌、香附（制）等20余味中药材加工制成，具有祛风除湿，通经活络，散寒止痛的功效，临床广泛用于风寒湿痹，肢节疼痛，肢体麻木[1]。其中，香附（制）在处方中具有行气止痛的重要作用[2]。追风透骨丸质量标准现收录于《卫生部药品标准·中药成分制剂第十八册》[3]和《中华人民共和国药典（2020年版）》[4]，上述标准仅将香附（制）列入鉴别项，缺乏对其含量的质控指标，可见其质量标准并不完善，而本制剂是国家医保目录甲类药品，临床治疗必需，且使用广泛。因此，对其质量进行全面、严格控制，十分必要。本文通过查阅文献[5-14]，建立高效液相色谱法（HPLC）测定香附（制）中α-香附酮和香附烯酮的含量，为追风透骨丸中香附（制）提供更全面、可靠的质量控制依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型安捷伦高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，配二极管阵列检测器）；BT125D型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司，感量：0.01/0.1 mg）。

1.2 试药与样品

对照品：α-香附酮对照品（中国食品药品检定研究院，含量：99.8%，批号：110748-202117）、香附烯酮对照品（Shanghai Standard Technology Co.,Ltd，批号：ST77690181）。试剂：甲醇（DIKMA，批号：50102）为色谱纯，乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200610）为分析纯，水为超纯水（自制）。样品：追风透骨丸购于市区零售药店，来源于同一药品生产企业，批号：K10061、K12089、P12099，规格：每10丸重1 g，质量执行标准：《中华人民共和国药典》。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-水（B）（65∶35）为流动相；流速为1.0 ml/min；柱温为30 ℃；进样量：5 μl；检测波长：254 mn。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品混合溶液的制备精密称取α-香附酮20.09 mg，置50 ml棕色容量瓶中，香附烯酮10.56 mg，置20 ml棕色容量瓶中，分别加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，再分别精密量取上述α-香附酮对照品溶液2 ml、香附烯酮对照品溶液4 ml，置同一10 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每毫升含α-香附酮80.36 μg、香附烯酮211.2 μg的混合溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取追风透骨丸细粉约20 g，置适宜圆底烧瓶中，加水200 ml，连接挥发油测定器，在挥发油测定器上端加水使充满其刻度部分，至有水流入烧瓶时为止，再加入乙酸乙酯1 ml，连接回流冷凝管，将圆底烧瓶置电热套中缓慢加热至沸，并保持微沸约1.5 h，停止加热，分取乙酸乙酯层，置10 ml棕色容量瓶中，再用少量甲醇冲洗冷凝管，将冲洗液并入上述10 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验分别精密吸取“2.2”项下对照品混合溶液、供试品溶液及阴性对照溶液[按照处方比例制备缺香附（制）的阴性样品，按“2.2.2”供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液]各5 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液在与对照品混合溶液色谱图相同位置处，出现保留时间一致的色谱峰，且与相邻色谱峰分离完全，分离度均大于1.5，符合要求，α-香附酮和香附烯酮理论板数均不低于8 000。阴性对照溶液色谱图中，未出现待测成分色谱峰，说明本方法专属性良好。见图1～3。

图1 α-香附酮和香附烯酮对照品混合溶液HPLC色谱

图2 追风透骨丸供试品溶液HPLC色谱

图3 追风透骨丸阴性对照溶液HPLC色谱

2.3.2 线性关系精密量取“2.2.1”项下对照品混合溶液1、2、5、8、10 μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，结果表明两种待测成分在各自检测质量范围内，线性关系良好。见表1。

表1 追风透骨丸中α-香附酮和香附烯酮标准曲线测定结果

2.3.3 精密度试验精密量取同一对照品混合溶液5 μl，注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件，连续进样分析6次，结果：α-香附酮、香附烯酮峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.40%、0.45%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验取同一批追风透骨丸（批号：K10061）细粉约20 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，同法测定，结果供试品中每克含香附烯酮0.041 mg，RSD值为1.0%，含α-香附酮0.021 mg，RSD为1.4%，说明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一批追风透骨丸（批号：K10061）供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h时，精密量取5 μl，注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件分析，分别记录待测成分峰面积，其24 h内的RSD分别为：0.6%、0.4%（n均等于8），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 回收率试验精密称取已知含量（香附烯酮0.041 mg/g、α-香附酮0.021 mg/g）追风透骨丸（批号：K10061）细粉约10 g，再分别加入浓度为2.074 mg/ml的香附烯酮对照品溶液0.2 ml和浓度为1.330 mg/ml的α-香附酮对照品溶液0.2 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，同法测定，计算各样品中香附烯酮和α-香附酮的加样回收率。见表2。

表2 样品中香附烯酮和α-香附酮加样回收率试验结果

2.4 样品的含量测定

分别对3批追风透骨丸中香附烯酮和α-香附酮的含量进行测定。见表3。

表3 追风透骨丸中α-香附酮和香附烯酮含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品待测成分制备方法的选取

本文考虑到追风透骨丸为中药成方制剂，由20余种中药材原粉直接入药制成，成分复杂，采用超声、加热回流直接提取的方法，得到的供试品溶液成分较多，色谱峰较难分离，而α-香附酮和香附烯酮均为香附（制）中具有挥发性的挥发油成分，故本文采用水蒸气蒸馏法对其进行提取，既符合待测成分本身的理化性质，同时又起到纯化待测成分的作用，结果表明该提取方法得到的供试品液相色谱图，杂质峰较少，待测成分色谱峰宜与相邻色谱峰分离，且分离度满足要求。

3.2 不同色谱柱的考察

本文分别采用美国安捷伦科技有限公司Agilent TC-C18、ZORBAX SB-C18和北京迪马科技有限公司Dimaonsil C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm），对建立的检测方法中色谱柱选用进行考察，结果用以上3种色谱柱得到的色谱图中，待测成分色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5，且理论塔板数均能达到8 000以上，符合要求，表明以上色谱柱均可用于该方法的检测，本文选用以上3种色谱柱中较为常用的ZORBAX SB-C18柱进行试验。