饥饿对日本囊对虾免疫及ATP酶活性的影响

赵思哲，李婉莹，李永闯，于淼淼，赖晓芳,2,3，王攀攀,2,3，于 飞，阎斌伦,2,3，吴 君，何孝锋，高 焕,2,3

( 1.江苏海洋大学 海洋科学与水产学院，江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏 连云港 222005； 2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005； 3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014； 4.连云港市海洋与渔业发展促进中心，江苏 连云港，222005； 5.连云港市启明水产有限公司，江苏 连云港，222005; 6.江苏孝丰农业科技集团有限公司，江苏 盐城 224000 )

不利环境导致的胁迫现象对水生生物而言是经常发生的，此时它们会通过调节自身的生命活动及各种酶的活性来应对环境胁迫[1-4]。在所有的环境胁迫中，饥饿是水生生物最容易受到的胁迫因子之一。一般而言，当饥饿胁迫发生时，水生生物的消化能力会随着饥饿时间的延长而变化，主要表现在其消化组织中一些酶的活性会发生改变[5]，同时消化器官的组织结构及功能也会受到损伤[6]。不仅如此，饥饿胁迫也会影响水生生物的免疫功能，导致代谢能力下降、抗氧化能力降低[7]等现象的发生。饥饿胁迫对甲壳类动物行为学影响方面的研究也有所报道，如在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中的研究表明，仔虾在饥饿前期寻食行为显著增强，随着饥饿时间的延长其活动行为明显降低[8-9]。但在饥饿胁迫下，甲壳类动物的生长、免疫和能量代谢方面的变化特征研究还较少。

日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)属节肢动物门甲壳纲十足目对虾科囊对虾属[10]，因其营养丰富、肉质鲜美，且易活体运输等优点，一直以来都是我国重要的海水养殖对象之一。目前，关于日本囊对虾在饥饿条件下的生长[11]、摄食[12]、代谢[13]及性腺发育[14]等方面的研究已经有所报道，但对于饥饿胁迫下不同组织的免疫功能和能量代谢相关酶活性变化的特征还缺少系统的分析。笔者以日本囊对虾为研究对象，探究饥饿胁迫对其不同组织(肝胰腺、胃和肠道)免疫相关酶及ATP酶活性的影响，为进一步优化日本囊对虾的科学、健康的养殖模式提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用日本囊对虾由江苏省连云港赣榆佳信水产开发有限公司提供，平均体质量(0.8±0.06) g，平均体长(4.7±0.2) cm。随机挑选健康、活力好的个体于1000 L养殖桶中暂养，暂养期间温度为25 ℃，盐度为28，pH为8，持续充氧。暂养期间日换水1/3，投喂2次(8:00和19:00)商品颗粒饲料(粗蛋白≥49.01%、粗脂肪≥7.24%)，每日投喂量为虾体质量的5%。投喂后1 h底部吸污。

1.2 饥饿胁迫试验

暂养3 d后选取体格健全、活力好的日本囊对虾，平均投放到9个60 L(50 cm×40 cm×30 cm)养殖箱中，每个养殖箱中放20尾。环境条件与暂养条件一致。为防止个体间残食，笔者设计了1种多层多格的格栅式养殖装置，每格放置1尾个体，在每层养殖格栅上铺设隔板。分别在饥饿0、3、6、9、12 d时取样，其中0 d设置为对照组，其余时间点为试验组。每次随机取9尾虾，每个养殖箱取1尾，用吸水纸吸干体表水分，测量虾的体长、体质量。取样时用手术刀切开头胸甲的外壳，挑取胃和肝胰脏组织，从尾宽处切取约0.2 g肌肉组织，每3尾虾的各个组织做成1个混样进行样品制备。将不同组织分别置于1.5 mL的离心管中，称量质量后先用液氮进行预冷后转置-80 ℃冰箱保存。

1.3 样品制备

向准确称量质量后的组织样品中按1 g∶9 mL的比例添加提前预冷的0.9%生理盐水，之后在冰浴中研磨5 min，将得到的研磨液4 ℃、2500 r/min离心(离心半径5.8 cm)10 min后吸取上清液，置于冰箱中-80 ℃保存待用。

1.4 酶活性测定

各组织的酶活性测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒，测定项目包括胃、肝胰腺、肌肉3种组织中的总蛋白含量及碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)、钙镁ATP酶(Ca2+-Mg2+-ATPase)活性，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.5 数据处理

日本囊对虾的生长评定指标选择肥满度。计算公式如下：

式中，CF是肥满度，mt是各取样时间点时日本囊对虾的平均体质量(g)，Lt是各取样时间点日本囊对虾的平均体长(cm)。

利用Excel和SPSS 26.0进行统计分析。对试验数据进行单因素方差分析，若各处理组数据具有显著性差异，再采用邓肯多重比较检验均值对各组数据的差异性，显著水平标准为0.05，试验数据采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 饥饿胁迫对日本囊对虾生长性能的影响

饥饿胁迫对日本囊对虾生长性能的影响见图1。在饥饿条件下，日本囊对虾体质量随胁迫时间呈下降趋势，除第3天外其他试验组数据与对照组相比均差异显著(P<0.05)，且从第6天开始下降趋势更为明显。日本囊对虾肥满度的变化趋势同体质量一致，这表明饥饿胁迫显著降低了日本囊对虾的生长性能(P<0.05)。

图1 饥饿胁迫对日本囊对虾生长性能的影响

2.2 饥饿胁迫对日本囊对虾各组织免疫相关酶活性的影响

饥饿胁迫对日本囊对虾免疫相关酶活性的影响见图2。在胃组织中，随着饥饿时间的延长，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性呈现先升后降的趋势，且在第3天酶活性达到最高值。过氧化氢酶活性除第6天外，其他各组与对照组之间差异显著(P<0.05)；除第3、6天外，各组间超氧化物歧化酶活性差异显著(P<0.05)。酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性均随着胁迫时间的延长呈现下降趋势，且各试验组酶活性均与对照组之间差异显著(P<0.05)。在肝胰腺组织中，过氧化氢酶活性先升后降，且在第3天达到最高值并与对照组差异显著(P<0.05)；酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性均随着胁迫时间的延长持续下降，在第12天降至最低，其中碱性磷酸酶活性下降幅度最大；各试验组酶活性与对照组差异显著(P<0.05)。在肌肉组织中，各免疫相关酶活性的变化情况与肝胰腺组织相类似，除过氧化氢酶外，各种酶活性均随着胁迫时间的延长呈现下降的趋势，其中碱性磷酸酶的变化幅度最小；过氧化氢酶活性在第3天达到最高值，随后显著下降(P<0.05)。

图2 饥饿胁迫对日本囊对虾免疫相关酶活性的影响

2.3 饥饿胁迫对日本囊对虾ATP酶活性的影响

饥饿胁迫对日本囊对虾ATP酶活性的影响见图3。在所有组织中，钠钾ATP酶和钙镁ATP酶活性均随着胁迫时间的延长呈现先升后降的趋势。

图3 饥饿胁迫对日本囊对虾ATP酶活性的影响

在胃组织中，钠钾ATP酶活性在第6天达到最高值；钙镁ATP酶活性在第3天达到最高并与其他各组差异显著(P<0.05)。在肝胰腺组织中，钠钾ATP酶活性相较于其他组织变化幅度最大；钙镁ATP酶活性在第3天达到最高后开始显著下降(P<0.05)，并在第12天达到最低值，与对照组间差异不显著(P>0.05)。在肌肉组织中，试验组钠钾ATP酶、钙镁ATP酶活性与对照组间均差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 饥饿胁迫对日本囊对虾生长性能影响

饥饿会严重影响水生动物的生长性能。在鱼类中，饥饿胁迫会使鱼体肥满度、肝体指数及性腺指数显著降低(P<0.05)[15]，还会对生殖系统造成损伤[16-17]。在虾类中的研究结果也与之相类似。莫桑比克草虾(Penaeusmonodonmozambique)在饥饿胁迫下体质量显著降低，同时肌肉中粗脂肪和粗蛋白的含量也显著降低[18]。本试验结果显示，饥饿对日本囊对虾生长发育具有显著的影响，其体质量和肥满度随着胁迫时间延长而显著下降(P<0.05)，这是由于日本囊对虾在饥饿前期利用体内储存的蛋白质和脂肪联合供能，而在后期则全部由蛋白质提供能量[13]，消耗体内储存的能量来维持生理活动导致了生长性能的降低。该结论与对凡纳滨对虾的研究结果[19]类似。

3.2 饥饿胁迫对日本囊对虾免疫相关酶活性的影响

过氧化氢酶是一种末端氧化酶，在自然界中广泛分布在动植物及微生物体内，在生物防御系统里担任着重要的角色。过氧化氢酶可以清除生物体内过量的过氧化氢，并将其分解为水和氧气，防止细胞发生病变。在动物体内，过氧化氢酶还可以降低细胞中的应激反应，在宿主受到外界的刺激或胁迫时起到抵御和保护的作用[20]。本试验结果表明，随着饥饿时间的延长，日本囊对虾的胃、肝胰腺、肌肉组织中过氧化氢酶活性呈现先升后降的趋势，这与口虾蛄(Oratosquillaoratoria)在饥饿胁迫下的表现[21]一致。在饥饿条件下，由于受到外界环境胁迫，机体会产生大量的自由基，此时过氧化氢酶在被诱导的情况下上调活性以维持机体的稳定，因此在饥饿第3天酶活性达到最高值，肝胰腺作为机体免疫的重要组织器官，其酶活性上调最为显著；随着胁迫时间的推移，此时机体已难以承受外界环境的胁迫，日本囊对虾各组织的抗氧化系统已经造成一定的损伤，还原自由基的能力下降，代谢紊乱，导致机体免疫能力下降，酶的活性也呈现显著下降的趋势。这与中华鳌绒蟹(Eriocheirsinensis)在饥饿状态下的表现一致[22]。

碱性磷酸酶是一种常见的非特异性磷酸酯酶，其主要任务是通过调节机体的新陈代谢，参与磷酸基团的转移和代谢活动，同时参与营养物质的消化吸收，维持生命活动需要[23-24]。当机体处于胁迫状态下，碱性磷酸酶活性会随之发生一定的变化以帮助机体适应环境[25]。本试验结果表明，在饥饿胁迫下，日本囊对虾胃、肝胰腺、肌肉组织中的碱性磷酸酶活性随着时间延长呈下降趋势，这表示随着饥饿时间的增加，日本囊对虾的免疫能力下降，体内碱性磷酸酶活性受到抑制，尤其是在肝胰腺组织中，酶活性下降趋势与其他两个组织相比极为显著。相同的结果在口虾蛄、仿刺参(Apostichopusjaponicus)中也有报道[26]。酸性磷酸酶同碱性磷酸酶，可以在生物活动中调节磷酸基团的转移和代谢，是一种重要的水解酶。本试验中，饥饿胁迫对日本囊对虾胃、肝胰腺、肌肉组织中的酸性磷酸酶活性的影响非常显著，并且随着时间的延长均呈下降的趋势，与碱性磷酸酶的变化趋势一致。在饥饿状态下，机体会消耗自身能量导致免疫功能下降，这也是酸性磷酸酶活性会随饥饿时间延长而下降的原因[27]。

超氧化物歧化酶是一种稳定性很高的酸性蛋白，在细胞和组织中承担着清除超氧化阴离子自由基的角色，对降低机体氧化损伤有至关重要的作用[28]。当机体处于胁迫状态时，体内的免疫细胞会产生自由基物质来清除外来入侵物；但当免疫反应过度时，这种非特异性免疫反应会无法分辨“敌我”，对蛋白质、核酸、脂肪等生命基本分子进行攻击，造成机体损伤[29-30]。在同一对象的不同组织中超氧化物歧化酶的含量也会不一致，在一般情况下肝脏部位的含量最高，这也与本试验结果一致。本试验结果表明，日本囊对虾胃组织中的超氧化物歧化酶活性随着胁迫时间的延长呈现先升后降的变化趋势，并在饥饿第3天达到最高值，这有可能是因为：机体受到饥饿胁迫时免疫系统自动开启来应对胁迫，酶活性增强；随着胁迫时间的延长，机体免疫能力已无法和外界胁迫相平衡，机体的能量也被消耗殆尽，酶活性下降。而在肝胰腺、肌肉组织中的超氧化物歧化酶活性随着饥饿胁迫时间的延长表现为下降的趋势，这有可能是由组织特异性所致。

3.3 饥饿胁迫对日本囊对虾钠钾ATP酶和钙镁ATP酶活性影响

钠钾ATP酶与钙镁ATP酶都是存在于细胞膜内的蛋白，其作用是物质运输、能量转换及信息传递等，它们是反映机体生长状况、渗透调节和生理代谢的重要指标。钠钾ATP酶能催化三磷酸腺苷的水解从而提供能量，使位于细胞膜两侧的钠离子、钾离子进行对向运输，对于机体调节细胞渗透压和离子平衡的生理活动有重要的调节作用[31-32]；钙镁ATP酶能够影响肌肉的收缩、神经细胞动作电位的传导、细胞的分泌和繁殖。本试验结果表明，随着胁迫时间的延长，日本囊对虾各组织中钠钾ATP酶和钙镁ATP酶活性均呈先升后降的趋势，这可能是因为：在饥饿胁迫下，机体调动储存在体内的糖原、蛋白质、脂质等物质来为自身供能以维持生命，此时线粒体供能需求增加，酶的活性经诱导后发生上调；在饥饿胁迫后期，一方面储存的供能物质被消耗殆尽，另一方面机体免疫系统遭受到破坏，产生的自由基极易使ATP酶中富含的赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸等发生修饰反应，使其结构发生变化，降低酶活性；同时饥饿胁迫后期脂质过氧化使细胞膜发生损伤，破坏膜的完整性和流动性，酶活性也随之下降。

4 结 论

综上所述，饥饿胁迫会对日本囊对虾的生长、免疫及能量代谢能力产生显著影响，并且在胃、肝胰腺、肌肉组织中不同的酶活性会因组织特异性呈相同或不同的变化趋势。笔者对日本囊对虾饥饿逆境的调节机制的研究结果，可为今后在养殖过程中制定更科学、更适量地投喂模式与策略提供一些先行的理论基础，以期提高日本囊对虾的养殖存活率和养殖产量，并为进一步优化日本囊对虾的养殖模式提供参考。