shRNA沉默SGK3基因抑制MB-474细胞凋亡、侵袭和转移潜能

彭芯 韩敬文 张雪宁 吴成伟 张生 郭红艳

(齐齐哈尔医学院 1 2017级影像2班，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2生物化学教研室)

在复杂的细胞信号转导网络中，血清/糖皮质激素调节激酶(SGK)3是细胞磷酸化级联反应的一个交汇点，其参与多条转导通路，在肿瘤发生发展、恶性转化、浸润、迁移等过程中发挥作用〔1～3〕，可能作为治疗某些肿瘤的潜在或判断预后标志物〔4〕。本课题组前期对SGK3在乳腺癌组织中的表达情况，与雌、孕激素受体、TNM分期等病理特征关系及其过表达对乳腺癌细胞恶性生物学行为影响等方面进行了研究〔5,6〕，在此基础上，课题组构建SGK3基因RNAi慢病毒载体，进而观察SGK3基因沉默后MB-474乳腺癌细胞的黏附、细胞凋亡、细胞迁移等生物学行为的变化，为进一步阐明SGK3在乳腺癌发生发展中的作用机制提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1材料 MB-474细胞、293T 细胞购自上海中科院细胞库，靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体PGC-LV3-SGK3由Gene Pharma构建制备；细胞培养瓶、培养板、tanswell培养板为Nunc公司产品；胎牛血清购自Gibco 公司；基质胶购自BD公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG为Santa Cruz公司产品；甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(GAPDH antibody)购自CST公司；SGK3多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；蛋白抽提、定量试剂盒购自Beyotime技术公司；膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自Jiamay生物技术有限公司。

1.2重组慢病毒感染MB-474细胞 构建靶向SGK3基因的shRNA慢病毒表达载体，人SGK3基因的特异性shRNA 分别为：SGK3-shRNA-1序列GGTATCCAGAACTTTATAACC；SGK3-shRNA-2序列GCATTGGGTTACTTACATTC；SGK3-shRNA-3序列GGGCTGTTCTGTATGAAATGC，通用序列(NC)作为阴性对照，将人乳腺癌MB-474细胞以7.5×105/孔的密度接种于6孔板培养，细胞50%以上融合时用5 μg/ml的聚凝胺(polybrene)介导以上重组慢病毒分别转染MB-474细胞，转染后72 h倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，经2 μg/ml嘌呤霉素筛选，得到稳定转染的细胞克隆。各组细胞分别命名为474-LV3-NC组、PGC-LV3-SGK3-1组、PGC-LV3-SGK3-2组和PGC-LV3-SGK3-3组。

1.3免疫印迹检测MB-474细胞SGK3蛋白表达 将各组细胞进行蛋白提取及含量测定，每组40 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转至NC膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗膜后4℃一抗孵育过夜(SGK3抗体1∶1 000稀释，GAPDH 抗体1∶2 000稀释)，1∶5 000稀释二抗室温孵育1.5 h，TBST洗膜，电化学发光(ECL)显色，蛋白表达以SGK3/GAPDH积分光密度表示。

1.4黏附实验检测细胞黏附性 在96孔培养板每孔中分别铺上25 μg基质胶4℃过夜，每孔加入2%BSA 20 μl，置于22℃ 1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，取 MB-474、474-LV3-NC、PGC-LV3-SGK3-1细胞2×104个/孔接种于96孔板(每组3个复孔)，37℃孵育90 min，用PBS洗掉未黏附的细胞，每孔加入MTT 10 μl，37℃培养孵育4 h，弃去MTT，每孔加入100 μl DMSO，酶标仪测定570 nm吸光度值，作为细胞黏附的指标。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 细胞培养48 h，0.25% 胰酶消化后PBS洗涤，进行Annexin V-FITC/PI染色(按试剂盒说明书操作)，流式细胞术检测细胞凋亡，记录488 nm激发波长下的红/绿荧光值，CellQuest软件分析检测结果。

1.6细胞划痕实验检测细胞迁移运动 将细胞按1×105个/孔植于6孔培养板上， 细胞长至60%～70%汇合，形成单细胞层，用20 μl无菌枪头进行细胞划痕(2条/孔)，PBS洗掉脱落细胞，继续常规培养，划痕后0、24、48 h显微镜下拍照，观测划痕修复情况，Image Pro-plus 软件分析划痕面积。

1.7细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力 细胞撤血清饥饿24 h，常规消化细胞，PBS洗2遍，用含0.2%血清培养基将细胞密度调为1×105/ml，Transwell小室上室中加入200 μl细胞悬液，下室加入10%血清培养基600 μl，每组3个复孔，培养48 h后取出Transwell小室，将小室中培养液弃去，棉签轻拭擦去未迁移细胞后PBS洗3遍，穿过膜的细胞在膜下层，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS冲洗，显微镜下随机5个视野观察细胞并计数、拍照。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0 软件进行方差齐性检验、方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1重组慢病毒感染乳腺癌MB-474细胞 将慢病毒载体转染乳腺癌MB-474细胞，72 h后荧光显微镜下可见各组细胞90%以上胞质中有较强的绿色荧光，即慢病毒成功转染MB-474细胞，且转染效率较高。见图1。

图1 重组慢病毒转染MB-474细胞后荧光显微镜下观察GFP(×40)

2.2慢病毒转染后下调SGK3的蛋白表达 与474-LV3-NC组(0.815±0.079)相比，PGC-LV3-SGK3-1组(0.174±0.076)、PGC-LV3-SGK3-2组(0.415±0.043)、PGC-LV3-SGK3-3组SGK3蛋白表达量(0.438±0.026)均显著降低(P<0.01)，PGC-LV3-SGK3-1组SGK3蛋白表达水平抑制效果最佳，与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

1～4：474-LV3-NC组,PGC-LV3-SGK3-1组,PGC-LV3-SGK3-2组,PGC-LV3-SGK3-3组图2 Western印迹检测MB-474细胞SGK3蛋白表达

2.3SGK3基因沉默对细胞凋亡的影响 MB-474组和474-LV3-NC组细胞凋亡率差异无统计学(P>0.05)，而PGC-LV3-SGK3-1 组细胞的凋亡率较前两组明显升高(P<0.05)。见图3、表2。

图3 流式细胞术检测各组MB-474细胞凋亡

表2 各组细胞黏附性、凋亡率、迁移能力比较

2.4SGK3基因沉默抑制细胞黏附 与MB-474组、474-LV3-NC组比较，PGC-LV3-SGK3-1组细胞的黏附性明显降低(P<0.05)。见表2。

2.5SGK3基因沉默对细胞迁移能力的影响 划痕后24、48 h MB-474组和474-LV3-NC组细胞迁移面积无明显差异(P>0.05)，PGC-LV3-SGK3-1组细胞与前两组比较，迁移面积显著更小(P<0.05)。见表2、图4。表明SGK3基因沉默能抑制MB-474细胞的侵袭。

图4 划痕实验检测各组MB-474细胞迁移能力(×10)

2.6SGK3基因沉默对细胞侵袭的影响 将细胞加入tanswell小室48 h后，MB-474组和474-LV3-NC组穿过微孔膜的细胞数分别为(27.8±5.02)个、(30.2±7.23)个，两者差异无统计学意义(P>0.05)，PGC-LV3-SGK3-1组穿膜细胞数为(21.67±4.82)个，数量明显低于前两组(P<0.01)。见图5。表明SGK3基因沉默细胞迁移的过程。

图5 Transwell检测各组MB-474细胞侵袭能力(结晶紫染色，×20)

3 讨 论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，目前该病被认为是影响女性身心健康“杀手”之一，该病的发生受到众多因素的影响，涉及多种基因参与及改变〔7～9〕，生物靶向治疗是目前乳腺癌治疗领域的热点和活跃领域，并逐渐成为乳腺癌综合治疗的一部分。

近年来学者们针对SGK3与包括乳腺癌在内的多种人类疾病及肿瘤发生发展的关系等问题进行广泛研究，研究结果提示，SGK3在多种小胶质细胞系中表达， SGK抑制剂可增强脂多糖诱导的炎症调节因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子(TNF)α的表达并增强核转录因子(NF)-κB的转运，SGK可能在调节小胶质细胞活力和炎症反应中起重要作用；SGK3是由雌激素受体(ER)调控的一种激酶，通过维持肌浆/内质网Ca2+-ATP酶(SERCA)2b功能介导ER信号传导，其在肿瘤血管生成、恶性转化过程中起到重要作用，有可能作为某些肿瘤治疗的潜在靶点和预后标志物〔10～13〕。本研究结果提示：SGK3基因沉默对MB-474细胞黏附能力具有抑制作用，SGK3基因沉默后可使乳腺癌细胞凋亡率升高，侵袭、迁移能力降低，提示SGK3基因沉默能有效抑制乳腺癌的部分恶性生物学行为。

乳腺癌的发生发展过程非常复杂， SGK3作为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)下游的独立信号分子，在该病中发挥的具体作用和机制仍处于探索和研究阶段，研究者们力求从多角度阐述SGK3与乳腺癌的关系。本课题组虽然已经进行了部分研究工作，但SGK3 基因沉默对乳腺癌细胞生物学行为产生影响的具体机制还要需要进行进一步后续研讨和研究，该基因与乳腺癌临床病理特征的相关性、是否与乳腺癌发生发展和预后相关，是否可以作为乳腺癌治疗的有效靶点及预后标志物等问题，是课题组今后的研究方向。