补肾降糖方对糖尿病肾病小鼠肾脏功能及肾小管上皮细胞自噬的影响

尹建平 庞欣欣 (河南省中医院肾病科,河南 郑州 450002)

糖尿病肾病(DN)为糖尿病常见微血管并发症，DN的发病机制尚无统一结论，通常认为与遗传、糖代谢紊乱、缺氧、内质网应激和氧化应激等多种因素关系密切〔1,2〕。研究显示，20%～40% 糖尿病患者出现DN，DN可导致终末期肾衰竭的发生，是糖尿病患者致死、致残的重要因素，严重威胁患者的生命安全。目前DN的治疗主要通过控制患者血糖及血压水平、抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)，从而降低阻滞蛋白尿及DN的发展进程，但对改善肾功能损伤作用有限〔3〕。因此，寻求有效DN治疗手段及治疗药物成为相关领域的研究热点。自噬是通过清除细胞内受损蛋白质及细胞器，避免发生细胞凋亡和坏死的高度保守的自身保护机制，自噬对维持细胞稳态具有重要意义。研究显示，在机体正常状态下肾脏肾小球足细胞及近端肾小管上皮细胞均处于较好的自噬水平，有效清除细胞内受损蛋白质及细胞器，机体的高糖状态可引起自噬功能抑制，导致肾脏内环境紊乱，最终诱发肾功能异常〔4,5〕。

中医药在多种疾病的治疗中具有独特优势，临床研究显示中药可有效改善DN患者临床症状，降低DN损伤，提高患者预后。传统中医理论并无关于DN的表述，依据其临床特点DN属“消渴”“水肿”“癃闭”范畴，肝肾之阴暗耗，瘀血壅阻经隧，络脉不利，瘀阻水停，治疗应以“补阴”“活血”立论〔6〕。补肾降糖方(BSJT)是由生黄芪、泽泻、白术、麦冬、黄柏、葛根、陈皮等组方，具有清热燥湿、补脾滋肾、利尿渗湿等功效。本研究以高糖高脂饲养联合链脲佐菌素(STZ)制备DN模型大鼠，观察补肾降糖方对DN模型大鼠肾脏功能及肾小管上皮细胞自噬的影响，探讨BSJT治疗DN的疗效及可能存在的作用机制。

1 材料与设备

1.1试验动物 PF级雄性SD大鼠60只，体重(150±15)g，由郑州市华兴实验动物养殖场提供，合格证号：SCXK(豫)2021-0013，所有动物饲养于清洁级动物室，(23±2)℃，湿度(55±15)%，12 h昼夜光照循环。

1.2试验药物 补肾降糖方基本方：生黄芪12 g、泽泻10 g、白术10 g、黄芪12 g、当归8 g、麦冬6 g、黄柏4 g、葛根4 g、陈皮4 g，加水1 L热回流提取1 h，提取2次，合并滤液，浓缩至50 ml(1.4 g生药材/ml)。

1.3试剂及设备 STZ(Sigma)；苏木素(Sigma)；兔抗人微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ单克隆抗体，兔抗人促凋亡蛋白Nix单克隆抗体，兔抗人 β-肌动蛋白(actin)单克隆抗体，兔抗大鼠磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)多克隆抗体(CST)；兔抗大鼠mTOR多克隆抗体(Proteintech)；兔抗大鼠蛋白激酶B(AKT)多克隆抗体和兔抗大鼠 p-AKT(Thr308)多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(武汉普美克生物技术有限公司)；高糖高脂饲料(南京市青龙山动物繁殖场加工)；Anke TDL-40B 型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；ABI7500型基因扩增仪(美国 ABI)；Mini Protean 3 Cell 型垂直电泳仪及显影设备(美国Bio-Rad公司)；奥林巴斯BX53型生物显微镜；7150自动生化分析仪(日立)；荧光定量PCR(美国ABI)；H-60透射电镜(日立)。

1.4造模、分组及给药 各组大鼠适应性喂养1 w后，高糖高脂饲料喂养2 w，尾静脉一次性注射STZ(溶于pH4.5，0.01 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液) 55 mg/kg，注射4 w后测定血糖及尿蛋白含量，以血糖≥16.7 mmol/L、尿蛋白含量≥20 mg/24 h为造模成功；对照组注射同等剂量无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。造模成功大鼠随机分为模型组，BSJT低、中、高剂量组〔2.8、5.2、7.0 g/(kg·d)〕及阳性对照组〔厄贝沙坦60 mg/(kg·d)〕，每组10只，按照给药剂量分别灌胃BSJT及厄贝沙坦，对照组及模型组灌胃同等剂量生理盐水，连续灌胃8 w。

1.5组织取材 末次给药后代谢笼收集 24 h 尿液并记录尿量(期间禁食不禁水)，1 400 r/min离心5 min，收集上清；10%水合氯醛麻醉，颈椎离断处死大鼠，腹主动脉取血，4℃ 3 000 r/min离心15 min收集上清；开腹分离肾脏，冰台除被膜，左肾4%多聚甲醛固定，保存于10%中性甲醛中；右肾切块，保存于-80℃冰箱中，采用Western印迹和qRT-PCR分析。

1.6血、尿生化指标检测 全自动生化仪测定血清空腹血糖(FBG)、血浆白蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、胆固醇(CHO)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；双缩脲法检测24 h尿总蛋白定量(U-Pro)。

1.7肾组织形态学观察 4%中性甲醛固定肾组织，经包埋，固定，切片，脱蜡，梯度乙醇洗脱，苏木精液染色，2%伊红染色液浸泡，梯度酒精脱水，中性树胶封片，光镜下观察肾组织形态学变化。

1.8透射电镜观察自噬小体 4%中性甲醛固定肾组织，常规丙酮脱水、包埋，超薄切片，3%醋酸铀、枸橼酸铅双染色，将制备好的样品用 JEM-1010 透射电镜观察自噬体。

1.9Western印迹法 取-80℃保存肾脏组织，解冻，加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)匀浆，提取总蛋白，测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，TBST洗膜加入LC3-Ⅱ，p62，Nix、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗体4℃孵育，加Ⅱ抗室温孵育1 h，洗涤、显影，以β-actin作为内参，Image Lab 图像分析软件进行定量分析，检测大鼠肾组织LC3-Ⅱ、p62、Nix 蛋白相对表达量。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用GraphPad Prism6.01软件作图。

2 结 果

2.1各组血、尿生化指标比较 模型组FBG、TG、CHO、Scr、BUN、24 h U-Pro水平显著高于对照组，ALB水平显著低于对照组(P<0.05)；与模型组比较，BSJT中、高剂量组及阳性对照组FBG、TG、CHO、Scr、BUN、24 h U-Pro水平显著降低，ALB水平显著升高(P<0.05)；BSJT高剂量组血、尿生化指标显著优于阳性对照组(P<0.05)，BSJT中剂量组与阳性对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组血、尿生化指标比较

2.2各组肾脏组织病理变化 HE 染色结果显示，对照组肾小管结构清晰，上皮细胞排列整齐，形态正常，管腔规则，大小均一，无明显萎缩、扩张或蛋白管型，间质内血管丰富，未见纤维组织增生及炎细胞浸润。模型组可见部分肾小管上皮细胞排列紊乱，肾小管腔内可见脱落细胞碎片，部分肾小管空泡样变性，胞质染色不均，部分肾小管轻度萎缩或管腔扩张，间质内伴有纤维组织增生及炎细胞浸润。BSJT低、中、高剂量组及阳性对照组肾小管病变可见不同程度的减轻，见图1。

图1 各组肾脏组织病理学观察(HE染色，×400)

2.3各组LC3-Ⅱ、p62、Nix水平比较 与对照组比较，模型组LC3-Ⅱ、Nix水平显著降低，p62水平显著升高(P<0.05)；BSJT中、高剂量组及阳性对照组LC3-Ⅱ、Nix水平高于模型组，p62水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组LC3-Ⅱ、p62、Nix及AKT、mTOR相关蛋白表达比较

2.4AKT/mTOR信号通路激活情况 与对照组比较，模型组p-AKT、p-mTOR蛋白表达量显著升高(P<0.05)，BSJT中、高剂量组及阳性对照组显著低于模型组(P<0.05)，各组AKT及mTOR蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图2。

1～6:对照组、模型组、BSJT低剂量组、BSJT中剂量组、BSJT高剂量组、阳性对照组图2 各组AKT/mTOR相关蛋白表达

2.5自噬体形态观察 透射电镜观察结果显示，对照组肾组织内可见大量自噬体聚集，线粒体形态完整，细胞内存在明显细胞器降解；模型组肾组织内仅观察到少量自噬体及大量形态异常线粒体；BSJT低、中、高剂量组肾组织自噬体数量呈浓度依赖性增加趋势，BSJT中、高剂量组及阳性对照组肾组织内双层膜结构明显，胞质内可见明显空泡，未见结构完整细胞器，见图3。

图3 各组肾脏组织自噬体观察(×40 000)

3 讨 论

调查显示我国糖尿病患病率达9.7%，据估计2045年我国罹患糖尿病人数将超过1.5亿，其中20%～40%患者继发DN，5%～10%糖尿病患者最终死于肾病，DN为重要的糖尿病致死因素〔7〕。目前对DN的发病机制仍未完全明确，普遍认为遗传、糖代谢紊乱、缺氧、内质网应激和氧化应激等因素与DN的发生关系密切〔8〕。

自噬是一种在溶酶体参与下降解细胞内老化、受损细胞器及蛋白质的代谢过程，是细胞高度保守的自我保护机制，在细胞自我净化、重构、维持内环境稳态等方面具有重要意义〔9〕。自噬调节在2型糖尿病发生发展过程中也起重要作用，自噬失衡可加重胰岛素抵抗及胰岛-β 细胞衰竭〔10〕。自噬作用对维持足细胞和近端小管细胞内环境稳态和功能均具有重要作用，机体在高糖状态下足细胞和近端小管细胞自噬水平降低，自噬体数量减少，肾小球及肾小管结构受损，出现肾功能异常及蛋白尿水平升高〔11〕。

标记蛋白LC3是形成自噬体的重要成分，LC3蛋白分为LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ两种形式，LC3-Ⅰ位于细胞质内，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜可与溶酶体相融合，LC3-Ⅱ可作为机体自噬水平的生物标志物，LC3-Ⅱ水平可直接反映自噬体数量〔12〕。p62蛋白在机体自噬过程中可被溶酶体清除，p62 蛋白水平可有效反映自噬体活性，当机体自噬处于较高水平时p62蛋白水平显著降低，因此 p62 蛋白也可以用来判断自噬过程是否通畅。Nix为线粒体自噬所需结合蛋白，对线粒体自噬具有关键调节作用。线粒体自噬随着Nix水平的增加而增强，Nix水平是反映线粒体自噬的重要指标〔13,14〕。

AKT/mTOR信号通路及其下游蛋白对细胞增殖、分化、凋亡均具有重要调控作用，同时AKT/mTOR信号通路也是参与细胞自噬的主要信号通路之一，磷酸化AKT可激活mTORC1从而抑制细胞自噬，mTOR水平与自噬标志蛋白LC3呈负相关〔15〕。

中医学并无 DN 之病名，DN 临床特点与“消渴”“水肿”“癃闭”相近，表现出正虚邪实，寒热错杂，虚实互见等特点〔16〕。在 DN初期阴虚为本以肝肾气阴两虚为主，治宜滋补肝肾，益气养阴；病变中期脾肾气阳两虚为主，治宜补益脾肾，利水消肿; 晚期阴阳气血俱虚，脏腑功能受损，水湿浊毒内停，变证蜂起，治宜通阳利水〔17〕。中药及复方在多种慢性疾病的治疗中均有显著疗效。补肾降糖方是由黄芪、葛根、泽泻、白术、麦冬、黄柏、陈皮等组方，黄芪为君，补气升阳，生津养血，利水消肿，行滞通痹；葛根生津止渴、泽泻利水渗湿，佐以白术、麦冬、黄柏、陈皮等养阴清热、涤痰活血，诸药合用具有清热燥湿、补脾滋肾、利尿渗湿等功效〔18～20〕。

综上，BSJT可有效改善模型大鼠血、尿生化指标，降低模型大鼠肾脏组织损伤，促进肾小管上皮细胞自噬，其作用机制可能与调控AKT/mTOR信号通路有关。