碳酸酐酶靶向探针的研究进展

杨燕玲，叶德举

（南京大学化学化工学院,生命分析化学国家重点实验室,化学和生物医药创新研究院,南京 210023）

碳酸酐酶（Carbonic anhydrases，CAs）是一类细胞中普遍存在的金属酶，其主要包括5种细胞基质形式（CA I，CA II，CA III，CA VII和CA XIII）、5种膜结合同工酶（CA IV，CA IX，CA XII，CA XIV和CA XV）、2种线粒体形式（CA VA和CA VB）和一种分泌的CA同工酶（CA VI）［1～7］.研究发现，CAs的活性主要是由活性口袋的氨基酸残基与金属Zn2+形成的配合物决定［8］.以人体中含量最丰富、研究最多的CA II为例［9］，其由260个氨基酸组成，是一种单结构域单体蛋白，具有混合α/β的球状结构蛋白质折叠形式［图1（A）］.CA II中心由8个β股折叠组成，中心两侧为7个α螺旋结构.活性位点Zn2+与3个组氨酸残基（H94，H96，H119）及1个羟基离子形成四面体配位.活性口袋主要由亲水性氨基酸（Y7，N62，H64，N67，T199和T200）和疏水性氨基酸（V121，V143，L198，T199，V207和W209）两种不同的环境组成.CA II调节pH的机理如图1（B）所示，活性口袋中Zn2+所络合的OH-亲核进攻CO2产生HCO3-；由于HCO3-与Zn2+的结合力较弱，易被水分子取代，释放出HCO3-，而与Zn2+络合的水分子进一步被活化为高活性的OH-，从而恢复CAs对CO2的催化活性.

研究表明，CAs的活性与肿瘤的乏氧微环境密切相关.在多种类型的恶性肿瘤（如胶质母细胞瘤［10］、结直肠癌［11］、乳腺癌［12］和肾癌［13］等）中，CAs的表达量会比正常组织细胞上调150～200倍［14］.在肿瘤细胞中，CAs通过催化CO2形成HCO3-的转换过程，参与调节肿瘤组织的微酸性环境［15］.以CA IX为例，作为跨膜蛋白，可催化细胞膜外CO2转化为HCO3-和H+，使CO2在细胞膜内外垂直方向保持浓度梯度［图1（C）］.这有利于CO2从胞内扩散到胞外，从而产生偏酸性的细胞外环境（pHe=6.5～6.8）和中性的细胞内环境（pHi=7.2～7.4）.此外，在细胞膜外产生的HCO3-被相邻的HCO3-转运蛋白（如NBCe1，NBCn1）重新转运进入细胞，进而在细胞质中与H+结合产生CO2，有助于降低细胞内的H+浓度，维持细胞内中性环境.

Fig.1 Crystal structure of human CA II[Ribbon cartoon representation of the crystal structure of CA II(PDB ID:3KS3),blue spheres:Zn2+ion](A),proposed mechanism of CA II-catalyzed conversion of CO2 to HCO3-(B)[9],cartoon illustration of the role of CAs in regulating extracellular(pHe)and intracellular pH(pHi)(C)[15]

鉴于CAs在肿瘤中的关键生物学功能，CAs已成为肿瘤诊断与治疗的一类关键生物靶标.快速、准确地检测CAs的活性对于肿瘤的早期诊断与及时治疗具有重要意义.通过抑制CAs的活性，可以有效改善肿瘤的酸性微环境和乏氧环境，有助于产生对肿瘤的协同治疗效果.近年来，针对CAs已构建了不同类型的分子探针，并成功应用于肿瘤的成像与治疗.目前，已有一些针对CAs靶向探针或抑制剂的报道，但它们主要集中在介绍CAs的生物功能［16］、靶向CAs的单光子发射计算机断层成像（Singlephoton emission computerized tomography，SPECT）或正电子发射断层扫描成像（Positron emission tomography，PET）造影剂［17］、抑制CAs活性的小分子化合物［18，19］.CAs靶向荧光探针和诊疗探针的研究进展尚未见报道.因此，本综述首先简要介绍了CAs的结构、活性及生物学功能；然后，重点介绍了CAs靶向荧光探针的构建与肿瘤成像应用和CAs靶向分子探针的构建与肿瘤协同治疗应用；最后，对靶向CAs的荧光探针和分子探针在肿瘤成像与治疗应用中所面临的挑战和未来研究方向进行了展望.

1 CAs靶向荧光探针的构建与肿瘤成像应用

荧光成像技术由于具有操作简便、灵敏度高等优点，已被广泛应用于细胞与生物活体内各种生物标志物的成像分析.为了检测CAs，构建了具有CAs特异性靶向的荧光探针，并成功应用于肿瘤细胞的高灵敏荧光成像.如2014年，Hamachi等［20］以罗丹明衍生物为荧光团，以CAs的抑制剂苯磺酰胺作为CAs的识别位点，通过引入可改善亲疏水性质的连接基团，构建了两亲性荧光探针1.探针1在水溶液中自组装形成纳米聚集体，使得罗丹明的荧光由于发生聚集诱导猝灭效应而降低.当聚集态与人乳腺癌MCF7细胞上高表达的CA II结合后，自组装的聚集体发生解组装，从而打开罗丹明的荧光信号［图2（A）］.溶液实验结果显示，探针1与CA II孵育30 min后，可以在585 nm处产生约30倍的荧光信号增强［图2（B）］.进一步的荧光成像实验结果显示，探针1与MCF7细胞孵育4 h后，在细胞质和细胞核中均产生明亮的罗丹明的荧光信号；当加入CA II抑制剂（Ethoxazolamide，EZA）后，细胞中产生的荧光信号被显著抑制［图2（C）］，证实细胞中的罗丹明荧光是通过探针1中的磺酰胺官能团与CA II之间的特异性结合而产生的.基于细胞中点亮的荧光，他们进一步将探针1应用于活细胞上CA II抑制剂活性的快速筛选.2015年，Tan等［21］基于类似的分子自组装与解组装方法，构建了CA IX可激活的近红外荧光探针，应用于乏氧环境中肿瘤细胞表面CA IX的检测和肿瘤细胞的免洗荧光成像.

Fig.2 Chemical structure and schematic illustration of probe 1 for the detection of CA II(A),fluorescence spectra change of probe 1 upon addition of CA II(B),confocal laser scanning microscope(CLSM)images of MCF7 cells incubated with probe 1 in the absence or presence of EZA(C)[20],chemical structures of AZ-BPS and BPS(D),fluorescence imaging of MDA-MB-231 tumor-bearing nude mice after intravenous injection of AZ-BPS or BPS(left),ex vivo fluorescence imaging of main organs resected from MDA-MB-231 tumor-bearing mice in the left[i:tumor(yellow circle),ii:liver,iii:lung,iv:kidney,v:heart,vi:spleen,vii:testis](right)(E)[22]

为了在活体上检测CAs的活性，Kim等［22］将CAs的抑制剂乙酰唑胺（Acetazolamide，AZ）与近红外光敏剂（Boron-dipyrromethene，BODIPY）通过点击化学方法共价链接，构建了可靶向CA IX的近红外光敏探针AZ-BPS［图2（D）］.借助AZ对CA IX高的亲和力和抑制作用，AZ-BPS能高效结合人乳腺癌MDA-MB-231细胞上高表达的CA IX，产生明亮的近红外荧光，从而点亮MDA-MB-231细胞.活体荧光成像结果显示，与不含AZ的对照探针BPS相比，AZ-BPS通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内后，可以在MDA-MB-231肿瘤部位产生显著增强的近红外荧光信号.离体器官的荧光成像结果表明，AZ-BPS主要蓄积在肿瘤组织中，而在其它主要器官（如肝脏、肾脏等）摄取较少［图2（E）］.由于BODIPY在近红外光照射下能产生具有细胞毒性的单线态氧，进一步将AZ-BPS成功应用于CA IX靶向的肿瘤光动力治疗（Photodynamic therapy，PDT）.

2 CAs靶向分子探针的构建与肿瘤协同治疗应用

PDT具有无创、副作用小及时空可控等优势.PDT的疗效与光敏剂在肿瘤细胞中产生活性氧物种（Reactive oxygen species，ROS）的能力密切相关，而肿瘤组织的乏氧微环境会限制ROS的生成，降低PDT的疗效.为了克服肿瘤乏氧影响，2019年，Pu等［23］设计了一种有机光动力纳米抑制剂（Organic photodynamic nanoinhibitor，OPNi）用于肿瘤的协同治疗.OPNi由有机半导体聚合物（PCVB，光敏剂）和共价修饰CA IX抑制剂（CAIs）的两亲性聚合物（CAi-b-PEG-b-PPG-b-PEG-CAi）通过纳米沉淀制备而成［图3（A）］.OPNi能够选择性地与CA IX高表达的肿瘤细胞结合，一方面提高其在肿瘤组织的摄取，另一方面调节CA IX调控的相关通路，发挥协同治疗效果.近红外荧光成像结果显示，OPNi经尾静脉注射进荷瘤小鼠体内后，在MDA-MB-231肿瘤部位产生的荧光信号显著高于未含有CAIs的对照纳米颗粒OPNc［图3（B）］.接着，在近红外光照射下，OPNi能够显著抑制肿瘤生长，效果明显优于对照探针［图3（C）］.Caspase-3的免疫荧光染色实验结果显示，OPNi介导的PDT可以在肿瘤组织上调更多的Caspase-3活性，证实OPNi通过靶向CA IX活性和PDT协同治疗可以产生显著的抗肿瘤效果［图3（D）］.

Fig.3 Schematic illustration of preparation of OPNi via nanoprecipitation approach(A),in vivo near-infrared fluorescence imaging of MDA-MB-231 tumors in living mice after intravenous administration of OPNi or OPNc(B),tumor growth curves in mice after treatment with indicated conditions(C),immunofluorescent staining(green fluorescence)of caspase-3 in tumor tissues resected from mice after different treatments(blue fluorescence:nuclei)(D)[23]

近年来，基于短肽小分子的自组装体系在生物组织工程、分子影像和药物递送等方面逐渐引起了人们的广泛兴趣［24～27］.2019年，Chen等［28］利用生物相容性较高的氨基酸短肽［2-Naphthaleneacetic acid-（D）-Phe-（D）-Phe-（D）-Lys-OH，N-pep］与CA IX抑制剂［4-（2-Aminoethyl）benzenesulfonamide，ABS］进行共价连接，构建了能靶向CA IX的短肽小分子化合物N-pepABS［图4（A）和（B）］.由于肿瘤细胞在乏氧条件下会显著上调细胞膜表面的CA IX表达，因此，N-pepABS可以在细胞膜表面高表达的CA IX作用下，发生自组装，堆积形成纳米纤维而粘附在细胞膜表面，表现出更强的CA IX结合能力和滞留效果，产生显著的CA IX的抑制活性，从而阻断乏氧肿瘤细胞的代谢及下游信号通路.粘附在细胞表面的纳米纤维进一步通过CA IX介导的内吞作用摄取进入乏氧肿瘤细胞的溶酶体中（Stage I），接着在溶酶体中酸性环境作用下，纳米纤维发生结构膨胀，进一步堆积形成尺寸更长的纤维（Stage II），戳破溶酶体（Stage III），引起溶酶体损伤和保护性自噬阻断（Stage IV），从而诱导肿瘤细胞死亡.因此，N-pepABS可以通过CA IX介导的自组装过程，有效靶向并杀伤乏氧肿瘤细胞，从而抑制肿瘤增殖.小动物实验结果表明，N-pepABS通过瘤内注射到荷瘤小鼠体内后，能够抑制4T1肿瘤的生长［图4（C）］.进一步与化疗药物阿霉素（Doxorubicin，DOX）联用，N-pepABS显著提高了对MDA-MB-231肿瘤的治疗效果［图4（D）］.

Fig.4 Schematic illustration of CA IX-targeting self-assembly of N-pepABS for the treatment of hypoxia tumors(A),the chemical structure of N-pepABS(B),photographs and average tumor weight of non-treated 4T1 tumors(Con)and N-pepABS-treated 4T1 tumors(C),the changes of tumors volumes in MDA-MB-231 tumor-bearing mice upon nontreatment(Con)or treatment with DOX,N-pepABS,N-pepABS together with DOX(D)[28]

与光动力治疗和短肽小分子自组装体系相比，化疗药物在临床上使用更为广泛.然而，当前化疗药物在临床使用时还面临肿瘤靶向性不足、副作用较大、易产生耐药性等挑战.为了提高铂类药物（如顺铂、奥沙利铂）的抗肿瘤效果，降低对正常组织的毒副作用，Mao等［29］设计并合成了两个CAs靶向的四价铂［Pt（IV）］前药分子Pt1和Pt2［图5（A）］，用于调节肿瘤微环境和代谢，进而增强铂类药物对实体瘤的治疗效果.Pt1和Pt2为分别将四价顺铂前药和四价奥沙利铂前药与两分子的CA IX抑制剂苯磺酰胺共价连接制备得到.一方面，Pt1和Pt2通过两个苯磺酰胺基团选择性地靶向肿瘤细胞表面高表达的CA IX，增强探针在肿瘤细胞的摄取，进而在肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）还原作用下，释放出顺铂和奥沙利铂原药，杀伤肿瘤细胞；另一方面，Pt1和Pt2通过抑制肿瘤细胞的CA IX活性，克服肿瘤组织的乏氧和微酸性环境，产生抗肿瘤血管生成的效果.因此，Pt1和Pt2能够发挥针对肿瘤的协同治疗效果，从而能有效抑制肿瘤生长［图5（B）］.

Fig.5 Chemical structures of Pt1 and Pt2(A),changes of the tumor volume in mice following nontreatment(control)of tail vein injection with Pt1,Pt2,Cisplatin or Oxaliplatin(B)[29],illustration of DOX@MSNs-CAIX for CA IX-targeted drug delivery and GSH-controlled release of DOX in tumors(C),the average tumor weight on 11 d after treatment with PBS,DOX@MSNs or DOX@MSNs-CAIX(D)[30]

2020年，Zhang等［30］以介孔硅（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）为载体，负载了化疗药物DOX，进一步通过二硫键将CA IX抗体（A-CA IX Ab）连接在MSNs表面，构建了DOX@MSNs-CAIX纳米颗粒，并应用于CA IX靶向肿瘤和GSH触发DOX释放的联合治疗［图5（C）］.DOX@MSNs-CAIX表面所连接的CA IX抗体能够与肿瘤细胞表面高表达的CA IX特异性结合，提高纳米颗粒在肿瘤部位的摄取.当DOX@MSNs-CAIX摄取进入肿瘤细胞内，进一步在肿瘤细胞内高浓度的GSH还原作用下，引起二硫键断裂，使得共价连接在MSNs表面上的A-CA IX Ab与MSNs解离，释放出MSNs内部的DOX，从而达到靶向肿瘤及化疗的协同作用.活体治疗效果显示，与只注射PBS或不含有A-CA IX Ab的DOX@MSNs相比，DOX@MSNs-CAIX可以更有效地抑制肿瘤生长［图5（D）］.

3 总结与展望

简要概述了近年来CAs靶向分子探针的研究进展，主要围绕CAs靶向的肿瘤荧光成像和CAs靶向的肿瘤协同治疗两部分内容进行总结.尽管这些基于CAs的分子探针在肿瘤的成像与治疗应用中取得了较好的效果，但仍然面临以下挑战：（1）基于CAs靶向的荧光成像探针的荧光发射波长主要在可见及近红外第一窗口（400～900 nm），在活体应用时难以实现深组织穿透深度、高信背比的成像效果；（2）大部分报道的分子探针主要与细胞膜上的CAs相互作用，较少能靶向细胞内的CAs；（3）靶向CAs的分子探针与化疗、PDT联合治疗时仍然面临肿瘤的多药耐药、肿瘤转移和复发等问题.针对这些挑战，未来针对CAs的研究将需要解决以下几方面问题：（1）开发能特异性靶向CAs的近红外II区（1000～1700 nm）荧光探针或多模态成像探针，以提高组织成像深度、信背比和成像分辨率；（2）构建能够靶向细胞内CAs的分子探针；（3）发展CAs靶向治疗与免疫治疗相结合的协同治疗，克服肿瘤的转移和复发.此外，系统研究这些靶向CAs的分子探针在体内的性能（包括药代动力学和毒理等），推动临床应用，也是未来需要进一步研究的方向.